α-伴大豆球蛋白诱导小鼠中性粒细胞释放胞外诱捕网

以小鼠作为模型动物,观察和验证豆粕当中的抗营养因子α-伴大豆球蛋白刺激小鼠中性粒细胞(PMNs)之后,是否能诱导其释放胞外诱捕网(NETs),并初步揭示其作用机制,从而为深入研究豆粕当中抗营养因子的作用机制提供参考。通过分离小鼠外周血PMNs,培养液中加入α-伴大豆球蛋白孵育后,激光共聚焦进行形态观察,Western blot检测细胞MAPK信号转导通路下游ERK和p38蛋白表达的影响,同时检测培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)。结果表明,α-伴大豆球蛋白能够刺激小鼠PMNs释放网状NETs结构,其上装饰有精氨酸、髓过氧化物酶等活性成分,NETs释放水平和加入的α-伴大豆球蛋白剂量呈正相关,且ERK和p38通路可能在α-伴大豆球蛋白诱导NETs释放过程中发挥作用,而LDH水平未见升高。以上结果证实豆粕当中的抗营养因子α-伴大豆球蛋白,刺激小鼠PMNs之后可诱导其释放NETs。     

副猪嗜血杆菌对猪肺泡上皮细胞氧化应激及细胞因子分泌的影响

为了研究副猪嗜血杆菌对猪肺泡上皮细胞氧化应激及细胞因子分泌的影响,试验采用CCK-8分析副猪嗜血杆菌HS1075与猪肺泡上皮细胞SJPL共孵育后细胞活力,利用ELISA试剂盒检测细胞GSH-Px、i NOS、MDA、NO、ROS、SOD和T-AOC变化,利用荧光酶标仪观察细胞ROS水平,利用LDH试剂盒检测细胞LDH水平;并用ELISA试剂盒检测细胞IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和TGF-β水平。结果表明:随着孵育时间延长,导致i NOS、MDA、NO和ROS氧化水平以及LDH水平逐渐升高,而GSH-Px、SOD和T-AOC抗氧化水平逐渐降低;猪肺泡上皮细胞分泌的IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α水平逐渐升高,而IL-4、IL-10和TGF-β逐渐降低。说明副猪嗜血杆菌可诱导猪肺泡上皮细胞发生氧化损伤,影响细胞因子分泌。     

沉默中性粒细胞Orai1影响NETs内ROS的表达

旨在研究不同时间与浓度的佛波肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)对奶牛中性粒细胞(PMN)形成中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)效果,筛选出PMA刺激时间与浓度,通过流式细胞术检测NETs状态下沉默中性粒细胞Orai1,检测钙离子与ROS水平。尾静脉肝素抗凝采集血液分离中性粒细胞,分别在不同时间与不同浓度PMA刺激下,根据激光共聚焦镜下观察NETs的形态状态。结果显示,在PMA在100 nm状态下刺激3 h时NETs形成状态效果最好。在沉默Orai1状态下,通过流式细胞检测结果显示,NETs内钙离子与ROS水平极显著降低。     

中性粒细胞在大肠杆菌感染大鼠乳腺损伤中的作用机制

36只清洁级SD怀孕大鼠于产后72h经乳头管灌注2×1012CFU/ml大肠杆菌悬液100μL/侧到第四对乳腺(两侧)内.分别于灌注前(定义为0h)及灌注后12、24、48和72h(n=6)颈静脉放血处死动物,采集样品.结果显示大肠杆菌诱发乳腺炎引起细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和中性粒细胞趋化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1,CINC-1)表达显著升高,从而促进嗜中性粒细胞(neutrophil,PMN)迁徙及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的释放,同时伴随着乳腺组织丙二醛(MDA)含量的显著升高.结果表明活化的PMN向乳腺组织迁徙是大肠杆菌乳腺炎的主要特征,PMN迁徙至感染部位通过释放ROS消灭病原菌,同时也是引起组织损伤的重要原因.     

中性粒细胞细胞外诱捕网的研究进展

中性粒细胞是机体先天性免疫系统中的重要组成成分,是外周血中数量最多的免疫细胞,在非特异性免疫中至关重要,是构成机体内抵御微生物入侵的第一道防线。近年来,人们发现中性粒细胞除了经典的通过胞吞作用吞噬病原微生物、释放嗜天青颗粒及产生并分泌抑菌杀菌物质外,还具有抵抗微生物入侵的新机制——中性粒细胞细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)。该机制主要通过活性氧和肽酰基精氨酸脱亚氨酶4等影响因子刺激中性粒细胞形成以DNA为骨架的网状结构,内含有多种蛋白酶,能非特异性捕获杀伤病原体,还能在机体某些疾病的产生和发展中起到协同作用。作者就NETs的形成、影响因素及与病原、疾病的相互关系作一概述,为进一步研究中性粒细胞的功能提供依据。     

高乙酰乙酸诱导中性粒细胞胞外诱捕网的形成

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是几年前才发现的一种重要的先天免疫防御机制,目前NETs的发生机制尚不清楚,但是当缺乏有效抗衡调节时,它又能损伤组织、引发自身免疫等疾病。本试验为了研究作为酮病奶牛高酮血症的主要成分之一的乙酰乙酸(ACAC)对NETs表达量的影响,体外添加不同浓度ACAC处理中性粒细胞,运用免疫荧光技术和激光共聚焦显微成像定性评价NETs的生成;采用PicoGreen~dsDNA染料定量检测细胞上清游离DNA和Western blot反映NETs生成量。结果显示,高ACAC组产生NETs的量显著高于对照组组(P0.05),表明高ACAC可以体外成功诱导中性粒细胞产生NETs。     

精氨酸对热应激诱导奶牛中性粒细胞凋亡的影响

旨在研究热应激对奶牛中性粒细胞(polymorphonuclear granulocyte, PMN)凋亡的影响,并探究精氨酸(L-arginine,L-Arg)是否对热应激诱导下的奶牛PMN具有保护作用。利用从健康奶牛分离培养的PMN构建体外试验模型,分为对照组(Con组,37℃)和热应激组(HS组,42℃培养0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h),通过CCK-8法检测细胞活性,确定最适热处理时间为2.5 h;将从健康奶牛分离得到的PMN与不同浓度(2、4、6、8、10 mmol/L)L-Arg预孵育30 min后,再置于42℃下培养2.5 h,利用CCK-8法检测细胞活性,最终筛选出L-Arg的最佳使用浓度为4 mmol/L。通过Western blot检测热休克蛋白70(HSP70)和凋亡关键蛋白c-CASP 3的蛋白丰度,流式细胞术检测PMN凋亡率。结果显示,相对于Con组,HS组PMN HSP70蛋白的丰度显著升高(P<0.01),c-CASP 3与CASP 3的蛋白丰度比显著升高(P<0.01),同时PMN凋亡率显著升高(P<0.01...     

分泌型核酸酶SsnA介导猪链球菌2型逃避中性粒细胞胞外陷阱捕杀的研究

为了研究猪链球菌分泌型核酸酶SsnA能否介导猪链球菌2型逃避中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的捕杀,试验通过构建猪链球菌2型(SS2)菌株的ssn A基因缺失突变株和回复株,比较三者在体外降解DNA的效率、降解NETs的能力及对NETs杀菌效率的影响。结果表明:ssn A基因缺失后的SS2不能在体外降解DNA及经PMA刺激诱导形成的NETs,同时降低了NETs对于SS2的捕杀作用。说明SS2能够通过胞外核酸酶SsnA来降解NETs的DNA骨架,从而逃避NETs的捕获作用而存活。     

猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制,通过气液界面培养技术(ALI),建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同毒力Mhp菌株感染对STEC分化细胞的影响。研究还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果表明:强毒株NJ株和中等毒力AH株组纤毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对纤毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48h最明显。Mhp菌株感染后还可促进分化细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L株外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经NAC抗氧化处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。本研究通过更接近体内环境的3D分化细胞感染模型证明,Mhp感染可对宿主细胞的生长特性与活性产生损伤,且损伤的程度与毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。     

犬细小病毒YBYJ株体外诱导MDCK宿主细胞凋亡的研究

为研究犬细小病毒(CPV)在体外能否诱导MDCK宿主细胞凋亡,本研究应用前期分离到的CPV YBYJ强毒株接种MDCK细胞,通过倒置显微镜观察CPV导致MDCK宿主细胞病变(CPE)情况,采用细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3活性检测试剂盒检测,观察CPV诱导MDCK宿主细胞凋亡情况。结果显示,CPV YBYJ强毒株可导致MDCK宿主细胞产生明显CPE,并出现明显的DNA Ladder,Annexin V-FITC/PI双染为阳性,Caspase-3活性显著升高,提示CPV在体外能够诱导MDCK宿主细胞凋亡。     

中性粒细胞细胞外诱捕网的研究进展

中性粒细胞是机体先天性免疫系统中的重要组成成分,是外周血中数量最多的免疫细胞,在非特异性免疫中至关重要,是构成机体内抵御微生物入侵的第一道防线。近年来,人们发现中性粒细胞除了经典的通过胞吞作用吞噬病原微生物、释放嗜天青颗粒及产生并分泌抑菌杀菌物质外,还具有抵抗微生物入侵的新机制--中性粒细胞细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。该机制主要通过活性氧和肽酰基精氨酸脱亚氨酶4等影响因子刺激中性粒细胞形成以DNA为骨架的网状结构,内含有多种蛋白酶,能非特异性捕获杀伤病原体,还能在机体某些疾病的产生和发展中起到协同作用。作者就NETs的形成、影响因素及与病原、疾病的相互关系作一概述,为进一步研究中性粒细胞的功能提供依据。     

中性粒细胞胞外诱捕网与病原体的相互作用及其机制

中性粒细胞作为机体天然免疫系统的重要组成部分，发挥至关重要的防御病原体感染的作用。中性粒细胞发挥防御作用的机制之一是通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）捕获并消灭病原体。然而有些病原体已进化出逃避NETs的机制，从而对机体造成持续损伤。此外，NETs的异常状态也会对机体造成一些损伤。近年来，NETs已成为中性粒细胞功能研究的热点，受到了国内外学者的广泛关注。有学者在禽的异嗜性粒细胞中也发现了类似NETs功能的网状结构，并将其命名为异嗜性粒细胞胞外诱捕网（heterophil extracellular traps，HETs）。作者主要对NETs抵御病原体入侵和病原体逃避NETs的机制并引起宿主致病等过程进行综述。     

以LPS构建IPEC1细胞损伤模型及相关指标的测定

本试验旨在研究脂多糖(LPS)刺激对猪肠上皮细胞系(IPEC1)细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、紧密连接蛋白和炎症相关基因表达的影响。分别选取0、0.025、1、10μg/m L的LPS刺激细胞1、2、4、8 h,检测相关指标。结果表明:在不同时间,不同浓度的LPS对细胞活力的影响未呈现出显著的规律性;与0、0.025μg/m L LPS组相比,在1、4、8h,1、10μg/mLLPS处理导致IPEC1上清液LDH活性显著升高;在不同时间,不同浓度的LPS对紧密连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1)和炎症相关基因(TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6)mRNA表达影响未呈现出显著的规律性。以上结果表明,LPS刺激能引起IPEC1细胞损伤,但不能诱导显著的炎症反应。     

钩吻素子对H_2O_2诱导的IPEC-J2细胞氧化应激和凋亡的影响

目的:探讨钩吻素子(koumine)对H_2O_2诱导的猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)损伤的保护作用及其机制。方法:通过MTT法检测koumine对IPEC-J2细胞增殖的影响,并用H_2O_2诱导IPEC-J2细胞建立细胞损伤模型,通过MTT和LDH比色法检测分析koumine保护IPEC-J2细胞免受H_2O_2损伤的效果;生化方法检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性;蛋白免疫印迹(western blot)技术检测凋亡相关蛋白bax和bcl-2的表达情况;用流式细胞仪检测氧自由基(ROS)释放量和细胞凋亡率。结果:检测浓度范围内koumine对IPEC-J2细胞没有毒性;koumine可以通过调控IPEC-J2细胞中SOD活性、LDH漏出率、MDA水平和ROS的产生,保护H_2O_2对IPEC-J2细胞的氧化损伤,抑制H_2O_2引起的IPEC-J2细胞凋亡;koumine在抑制H_2O_2引起的细胞凋亡过程中,减少了促凋亡蛋白Bax表达,增加了抑凋亡蛋白Bcl-2表达,使得Bax/Bcl-2的比值在药物作用时随剂量的增加逐渐降低。结论:koumine能够保护IPEC-J2细胞对抗H_2O_2诱导的氧化损伤,具有一定的时间和剂量依赖关系,其作用机制与抑制细胞凋亡有关。     

橙皮苷抑制LPS诱导的肠上皮细胞炎性损伤及其机制研究

本研究通过建立脂多糖(LPS)诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)炎性损伤模型,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率和细胞划痕愈合率,以评估橙皮苷对LPS诱导的IEC-6细胞炎性损伤的保护作用;通过Western blot法测定NLRP3、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和IκB等蛋白的表达及炎性因子TNF-α的分泌水平,以探讨橙皮苷对IEC-6细胞炎性损伤的保护作用机制。结果表明,橙皮苷显著抑制LPS诱导的IEC-6细胞Caspase-1和IκB的激活,抑制炎性因子TNF-α的分泌,进而抑制细胞活性的降低以及迁移能力下降,从而保护IEC-6细胞免受LPS诱导的细胞炎性损伤。     

不同性别大白猪肌肉全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析

旨在通过不同性别大白猪的全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析,检测差异甲基化区域(DMR)和差异甲基化基因(DMG),为进一步解析公母猪骨骼肌发育差异奠定基础。本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术分析了4头210日龄长白猪(公、母各半)背最长肌全基因组DNA的甲基化程度和差异甲基化区域,探讨性别间DNA甲基化水平的差异。结果表明,全基因组范围约有5%的胞嘧啶(C)发生了甲基化(mC);母猪和公猪的总体甲基化水平基本一致。共检测到1 629个DMRs和841个DMGs。母猪的DMRs平均甲基化水平明显高于公猪。通过基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)分析,共检测到171个GO条目和10个信号通路,显著富集在轴突导向、细胞连接、细胞粘附、ECM受体互作等相关过程中;筛选出5个与不同性别肌肉调节相关的候选基因。本研究绘制了不同性别大白猪的高分辨率单碱基全基因组甲基化图谱,为不同性别表观遗传研究以及肌肉发育和肉质相关候选基因的筛选提供了信息参考。     

桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜形成及cidA表达的影响

为研究桃柁酚对金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜形成的影响及其机制,本研究通过结晶紫半定量法和激光共聚焦显微镜检测桃柁酚对S.aureus生物膜形成的影响,利用实时定量RT-PCR分析桃柁酚对cidA及其调控基因的作用,并测定了桃柁酚对胞外DNA (eDNA)释放的作用及对HaCaT细胞的细胞毒性.结果表明,桃柁酚可以有效减少eDNA的释放并抑制S.aureus生物膜的形成,并且抑制趋势呈剂量依赖关系.此外,在1/8×MIC药物浓度时,桃柁酚可以诱导eDNA的释放并诱导生物膜形成.桃柁酚可以通过影响agr和sar调控系统,作用于cidA基因进而影响eDNA释放及生物被膜的形成.而且,4×MIC浓度的桃柁酚对人体无毒害作用.本研究为治疗S.aureus感染提供新的方法,并为进一步研究桃柁酚的作用机制奠定了基础.     

妊娠母猪细胞免疫水平及与孕酮、雌二醇关系的研究

采用非特异性酸性α醋酸萘酯酶(ANAE)染色、PHA诱导的淋巴细胞转化、放射免疫(RIA)测定等方法,测定了15头杜洛克杂种母猪第1胎产后断奶1～3d(未妊)及第2胎妊娠30～40d、41～50d、51～60d等不同时期的细胞免疫水平和外周血浆中孕酮、17β雌二醇含量。结果,未妊与不同妊娠期母猪之间T淋巴细胞百分率无明显差异(P>0.05);PHA诱导的淋巴细胞转化率,妊娠猪明显低于未妊猪(P<0.01),不同妊娠期间差异不显著(P>0.05);妊娠初期外周血浆17β雌二醇含量较低,孕酮含量明显高于未妊猪(P<0.01),不同妊娠期间差异不显著(P>0.05)。外周血浆孕含量与PHA诱导的淋巴细胞转化率之间存在着负相关(r=-0.51,P<0.01),表明孕酮具有免疫抑制作用。     

孕酮诱导精子趋化分离的微流控芯片对优选精子质量的影响

基于孕酮可以诱导精子趋化的特性,本实验旨在研究不同长度微流控芯片对精子质量及线粒体活性的影响。通过自行设计制作微流控芯片,将对照组、5 mm孕酮诱导组、7.5 mm孕酮诱导组、10 mm孕酮诱导组对冷冻奶牛精液进行优选,通过自动精子质量分析仪检测精子质量,并采用JC-1染色方法与上浮法比较,通过荧光显微镜检测精子线粒体活性。结果表明:7.5 mm孕酮诱导组的精子活率、直线速度、鞭打频率、前向性测定指标较其他3组显著升高(P0.05);摆动性、线性度、移动角度指标与其他3组差异不显著(P0.05);7.5 mm孕酮诱导组精子畸形率较对照组、5 mm孕酮诱导组显著降低(P0.05);7.5 mm孕酮诱导组分离出的高活性线粒体精子个数与上浮法相比显著升高(P0.05),均衡线粒体活性精子和低活性线粒体精子指标差异不显著(P0.05)。7.5 mm长度的微流路精子分离器分离出的精子无论是在质量参数还是线粒体活性上均达到了最佳效果,具有较高的精子优选能力。     

猪流行性腹泻病毒诱导Vero E6细胞凋亡的动态研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞产生病变及细胞凋亡的动态变化,本研究应用western blot、间接免疫荧光、细胞活性计数(CCK-8)等方法检测PEDV感染Vero E6细胞后不同时间点细胞内病毒含量、细胞活性、凋亡小体的形成,以及相关凋亡因子的变化。结果表明,感染后24 h细胞内病毒含量开始明显升高,48 h时达到峰值。同时在病毒感染24 h后出现明显的细胞病变,感染48 h后出现典型的凋亡特征,细胞聚堆,细胞核内染色质固缩,形成凋亡小体。CCK-8分析检测结果显示,与对照组相比感染病毒细胞活性明显降低。另外,western blot结果表明促凋亡因子蛋白水解酶Caspase-3在病毒感染过程中被活化。该研究结果进一步证实了PEDV感染可以诱导细胞凋亡,其中Caspase-3的激活在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。