马抗埃博拉病毒免疫球蛋白F(ab′)_2的制备及效果评价

采用昆虫杆状病毒表达系统,分别制备埃博拉病毒(Ebola virus,EV)埃博拉-扎伊尔(Ebola-Zaire,Z-E)、埃博拉-苏丹(Ebola-Sudan,S-E)病毒样颗粒(virus like particles,VLP)抗原,利用区带离心法和层析法两步纯化抗原,2种抗原等量混合并加入等量不完全佐剂充分乳化,免疫马匹;当利用自制的Z-E、S-EEV假病毒测定血清的中和抗体效价均达120/μL时,采血,分离血清,按照免疫球蛋白F(ab′)_2生产工艺制备治疗性抗体成品,并对其进行中和抗体效力、安全性检测。结果显示,包装的2种假病毒滴度均在40 000荧光值/μL以上;纯化的2种VLP抗原浓度均在3 mg/L以上,纯度均在95%以上;纯化的F(ab′)_2成品,纯度在90%以上,中和抗体效价均超过100/μL;安全性符合现行《中国药典》要求。结果表明,建立了马抗EV免疫球蛋白F(ab′)_2制品生产工艺,制备的成品符合现行《中国药典》要求,为埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)治疗提供理论依据。     

埃博拉病毒抗体间接血凝检测方法的建立

以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒中和试验检测结果相比较。结果显示,该方法可特异性检测EBOV抗体,与马尔堡病毒、裂谷热病毒等的阳性血清均不发生反应;与假病毒中和试验测得的抗体效价增长规律相一致。结果表明,本试验成功建立了EBOV抗体间接血凝检测方法,该方法安全、简便、快捷,为EBOV疫苗免疫后的效果评价提供了又一新的检测方法。     

白羽肉鸡标准化规模养殖模式下的生物安全与对策

1疫苗生产工艺、条件与生物安全及其对策在我国现行多数传统动物疫苗的生产工艺中,仍然多采用以下几种病毒扩增的宿主系统:鸡胚源(尿囊液病毒抗原)、鸡胚成纤维细胞培养源(细胞培养物病毒抗原)、动物其它细胞培养源(细胞培养物病毒抗原)、含毒动物组织源(感染组织     

鸡传染性支气管炎微量血凝抑制试验方法的研究

用胰酶处理鸡传染性支气管炎病毒(IBV)制成血凝(HA)抗原,HA＝1:16384,用此抗原建立了微量血凝抑制试验(HI)方法检测IBV阳性血清。IBV阳性血清鸡胚病毒中和试验(NT)结果与HI效价呈正相关,相关系数r＝0.29,HI效价达1:8以上可保护鸡胚抵抗200个MLD的IBV攻击,表明HI抗体是保护性抗体,该方法具有较大的实用价值。     

鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定

本研究采用鸡胚繁殖NDV-XX08,差速离心法纯化NDV,用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与NSO细胞进行融合,用间接ELISA和血凝抑制试验(HJ)进行筛选,挑选效价高的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆,建立阳性杂交瘤细胞株,最终得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为4F12。采用体外细胞培养和体内诱生腹水的方法制备了其McAb。对获得的单克隆抗体采用ELISA,HI,Western-Blotting方法进行鉴定。杂交瘤细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1:160和1:3.2×10~4。获得的单克隆抗体与NDV具有良好的特异性反应,与鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织、鸡[gG、鸡传染性囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感检测抗原均无交叉反应性。HI试验表明,制备的单抗没有血凝抑制活性。Western-Blotting证明获得的单抗与新城疫病毒蛋白有特异性反应。经连续传代20次,冻存、复苏3次,4F12杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体。     

大型生物制药厂的病毒鸡胚培养

鸡胚培养是培养某些病毒的常用方法,可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。现代化大型生物制品厂采用尿囊腔接种法培养病毒液用于生产疫苗,生产实践早已证明,种蛋的质量、抗原生产工艺对生成尿囊液量及其效价高低起决定作用,直接影响产品质量和鸡免疫后的抗体水平。本文结合某些大型兽用生物制品企业生产案例,对病毒鸡胚培养进行阐述。     

检测新城疫病毒中和抗体的间接ELISA和竞争ELISA方法的初步建立

鸡新城疫(ND)是由鸡新城疫病毒引起的急性传染病，是对养禽业危害最大的禽病之一。融合蛋白(F)是NDV的主要保护性抗原，对新城疫的免疫保护起着重要的作用。基因工程苗是防治ND的一种新型疫苗，本室在前期研究中，以282E4株鸡痘病毒为载体表达了NDV F40E8株的F基因，在SPF鸡上显示了较好的保护效力，但F蛋白激发机体产生的中和抗体用常规的HI试验无法测出抗体效价。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株鸡胚增殖工艺研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41标准毒株在鸡胚上的最佳生产工艺,试验用IBV M41株分别以不同剂量接种同一胚龄不同鸡胚、不同胚龄普通鸡胚,以及IBV M41株接种普通鸡胚后不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备病毒液的产量及病毒效价。结果显示:IBV M41株接种无传染性支气管炎病毒母源抗体的SPF鸡胚最佳病毒接种剂量为104.5EID50,接种含有IBV母源抗体的普通鸡胚最佳病毒接种剂量为105.1EID50,最佳接种胚龄为11日胚龄,最佳收毒时间为48 h。按照此工艺制备疫苗,免疫SPF鸡,IBV抗体效价均符合规程标准。研究结果为用鸡胚高效、大量生产IBV M41株病毒抗原进而生产合格的IB疫苗提供了数据支持。     

悬浮培养和鸡胚尿囊液抗原制备的H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较试验

为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。     

一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG_(2b),亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10~(11) L/mol,只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2~4和1∶2~6,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。     

对鸡卵黄免疫球蛋白两种提取方法的比较

本文比较了水稀释-饱和硫酸铵沉淀法（法一）和水稀释-冰乙醇分级沉淀法（法二）分离提纯鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）的产率、纯度及抗体效价。结果表明：两种方法提取的IgY纯度均较高,法一纯化的IgY的产率及蛋白活性相对更好。     

鸡抗鸭病毒性肝炎(DVH)高免卵黄抗体的研制

应用雏鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒株和ＤＶＨ油乳剂苗免疫鸡制备了高免卵黄抗体。通过实验室试验及临床应用,表明卵黄抗体治ＤＶＨ的疗效取决于卵黄抗体的呼效价和治疗的时间。卵黄抗体的中和效价应达２＾８．５以上,并且在感染ＤＶＨ２４ｈ以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果为最适宜。     

鸽Ⅰ型副黏病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备鸽Ⅰ型副黏病毒融合蛋白(F蛋白)的单克隆抗体,以鸽Ⅰ型副黏病毒F基因抗原重组蛋白免疫BALB/C小鼠,得到能稳定分泌抗F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3株。对效价最高的一株进行特性测定,结果显示其腹水抗体效价达到6.4×104以上,细胞培养上清液的效价达1︰800,其抗体亚类为lg G 2b,轻链为κ链,染色体数目为98条;血凝抑制试验显示单抗没有血凝抑制效价;间接ELISA进行特异性试验表明单抗与鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、鸡马立克氏病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、羊痘病毒、大肠杆菌、沙门氏菌没有交叉反应,而与鸡新城疫病毒具有较强的交叉反应。PPMV-1 F蛋白单克隆抗体的制备为鸽Ⅰ型副黏病毒病新诊断方法的建立奠定了基础。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的研制

本试验从山东地区分离的多株Ⅰ型鸭病毒性肝炎毒株中筛选出免疫原性优良毒株CL,将其在SPF鸡胚中盲传致弱后制备鸭肝炎弱毒疫苗。安全检验、保存期和免疫效力试验结果表明。研制的鸭肝炎弱毒疫苗安全可靠,无毒副作用;-20℃条件下可保存6个月以上;接种后抗体产生快,3d便可产生较强的免疫力,7d时抗体中和效价为2^63,一次免疫抗体可维持6周以上。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的研制

本试验从山东地区分离的多株Ⅰ型鸭病毒性肝炎毒株中筛选出免疫原性优良毒株CL,将其在SPF鸡胚中盲传致弱后制备鸭肝炎弱毒疫苗。安全检验、保存期和免疫效力试验结果表明,研制的鸭肝炎弱毒疫苗安全可靠,无毒副作用;-20℃条件下可保存6个月以上;接种后抗体产生快,3d便可产生较强的免疫力,7d时抗体中和效价为26.3,一次免疫抗体可维持6周以上。     

鲤鱼IgM的分离纯化及其抗血清的制备

为了分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并制备该蛋白的多克隆抗体,试验用rProtein A FF亲和层析和Superdex200 Increase 10/300GL分子筛的方法分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并通过SDS-PAGE对纯化蛋白的部分特性进行分析;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果表明:从鲤鱼血清中分离纯化出鲤鱼IgM蛋白,纯化后纯度可达99.53%;重链和轻链的分子质量分别为81.3 ku、26.4 ku;兔抗鲤鱼多抗效价高达1∶640 000以上。说明试验所采用的rProtein A FF亲和层析法可提取到高纯度的鲤鱼IgM,适合在实验室纯化鱼类IgM。     

一种犬细小病毒基因工程抗体的制备

本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒（canine parovirus，CPV）基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型；采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性；经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列，将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接；分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H，将载体共转染HEK-293细胞，采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性；采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量；用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定；间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示，CPV单克隆抗体亚型为IgG_2b，亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10¹¹ L/mol，只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H；HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2⁴和1∶2⁶，中和试验结果显示，HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290；鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L，SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带，表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明，纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体，为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。     

鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定

为研究鸡E.tenella的宿主细胞--盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定.结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%.用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞.     

H5N1亚型禽流感变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫原性研究

本实验对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re-4株接种SPF鸡胚后37℃培养72 h,鸡胚存活,无病变,HA滴度达29;以0.1 mL(106.0EID50/0.1 mE)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡7 d后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re-4重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡后,3周后平均HI抗体效价达8.75 log2:免疫鸡对亲本强毒株CKSX/06,以及变异株CKNX/06和流行株GSGD/96攻击提供完全保护.以上结果表明变异株灭活疫苗种毒Re-4株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,并且以该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是研制预防H5N1亚型禽流感病毒山西变异株的理想疫苗种毒株.     

膜分离法纯化浓缩猪繁殖与呼吸综合征灭活病毒的效果试验

将效力检验不合格的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒灭活液采用不同孔径的微孔滤膜、超滤膜滤除杂蛋白、超滤浓缩、除菌处理得到纯化浓缩的PRRS灭活病毒液;将检验合格的纯化浓缩的病毒灭活液与注射用矿物白油佐剂制成油包水灭活疫苗;对制备的灭活疫苗进行各项检验及免疫效果试验。结果显示,纯化的PRRS灭活病毒液杂蛋白去除率平均达到66.8%以上;灭活疫苗的物理性状与无菌检验、安全检验、效力检验均合格,免疫猪体内抗PRRS病毒抗体消长幅度比同时期未纯化的常规灭活疫苗明显,其中免疫至63 d时中和抗体效价(ELISA)平均高达245.7稀释倍数,比常规疫苗中和抗体效价平均高出66.3稀释倍数。试验表明,灭活病毒进行膜纯化技术处理后,免疫效果显著高于传统的灭活疫苗。