寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立

为了直观、高效、特异性地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞和组织中PRRSV RNA,本研究根据HP-PRRSV Hu N4株ORF7基因序列设计8对28 bp~36 bp双"Z"结构的寡核苷酸探针(PRRSV-Nprobes),建立了一种新的PRRSV RNA原位杂交检测的方法。该方法能特异性的检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中PRRSV RNA,而对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)感染PAMs中的核酸呈现阴性。应用该方法检测PRRSV感染仔猪肺脏、腹股沟淋巴结和胸腺石蜡包埋组织切片中PRRSV RNA,在感染的腹股沟淋巴结中PRRSV RNA呈现集中分布,而PRRSV RNA在肺脏和胸腺中呈弥漫性分布。该方法可用于细胞和组织中核酸的定位及分布规律的研究,特别是用于病毒含量较少的潜伏感染的检测,为PRRSV实验室检测和致病机理研究奠定了良好的试验基础和技术支持。     

猪萨佩罗病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)是一种无囊膜、球形的单股正链RNA病毒,属于微RNA病毒科,能引起猪脑脊髓灰质炎、肠道、呼吸道、生殖器官疾病等多系统综合征。本试验依照已经在NCBI发表的中国地区猪萨佩罗病毒基因序列设计合成了1对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速高效检测PSV的RT-PCR方法。结果表明,建立的RT-PCR检测方法特异性高、敏感性好,对PSV的最低检测限为4×103拷贝/μL;利用优化后的RT-PCR方法对2014~2016年间我国7个省市的345份临床样品进行检测,结果显示,临床PSV感染的感染率为8.12%(28/345),表明我国猪场中存在PSV感染。     

猪萨佩罗病毒对仔猪的致病性

猪萨佩罗病毒(PSV)是我国近年来新报道的仔猪腹泻病原,为深入了解PSV对仔猪腹泻的致病作用,本研究建立了PSV感染仔猪模型,通过对感染仔猪临床症状、剖检及组织病理学变化观察发现PSV能感染仔猪并导致发病,临床仔猪表现体温下降、出现腹泻症状,腹泻率可达80%,病死率20%。组织病理学观察肠道、肺脏及淋巴结病变明显,肠道绒毛受损,肺脏和淋巴结炎性细胞浸润。感染仔猪组织脏器病毒载量检测显示,病毒主要定植在肠道、肺脏和淋巴组织。荧光定量PCR对外周血中相关细胞因子水平检测,攻毒初期IL-1α、IL-6细胞因子上升明显,后期IL-2水平升高较快;抗病毒因子MX1水平持续上高,在14 d左右达到高峰。结果表明,PSV感染低日龄仔猪可引起腹泻,甚至死亡;病毒定植部位以肠道、肺脏及淋巴组织为主;感染后能诱导仔猪机体产生高水平细胞因子及抗病毒因子,攻毒仔猪体内先诱导产生TH2型体液免疫反应为主的抗炎性反应为主,后期以诱导TH1型促炎症反应的免疫应答为主。     

生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸

据GenBank中有关鸭瘟病毒(DPV)的1个765 bp的EcoRⅠ片段序列,用Oligo软件设计长度为37 bp的寡核苷酸并用生物素标记制备探针,经blast分析和斑点杂交检测探针的特异性后,建立从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法并对人工感染死亡鸭的各组织器官进行检测,结果显示:(1)寡核苷酸探针能特异性检测到DPV强毒CHv株DNA,对鸭病毒性肝炎病毒QL79株RNA、血清1型鸭疲里默氏杆菌DNA、鸭源多杀性巴氏杆菌DNA、鸭沙门菌DNA和大肠杆菌DNA的检测结果为阴性.(2)以寡核苷酸探针建立的从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法的最佳反应条件为:组织切片先用0.2 mol/L HCl 37℃处理20 min,然后用100 mg/L的蛋白酶K 37℃消化15 min左右;杂交时探针工作浓度为350 μg/L;Avidin-AP的工作稀释度为1:100.(3)以所建立的原位杂交法检测DPV-CHv强毒人工感染死亡鸭的各组织器官,结果肝脏、肠道、法氏囊、脾脏、食道、肺脏和肾脏呈阳性反应,DPV的DNA分布于特定细胞的细胞浆和细胞核.结果表明,原位杂交检测石蜡切片中DPV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DPV进行检测和病原定位的良好方法,可用于DPV的侵染过程和致病机理研究及回顾性诊断检测.     

宁夏两家猪场猪萨佩罗病毒的检测与多样性分析

为了解宁夏地区猪群中萨佩罗病毒(PSV)的感染流行情况,本研究通过RT-PCR的方法对不同区域的2个规模化养猪场的160份临床健康猪咽拭子和肛拭子样品进行了检测。试验表明,所检的2个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为61.25%,其中咽拭子检出率为7.5%,肛拭子猪检出率为58.75%。试验结果表明PSV在宁夏地区普遍存在。     

猪萨佩罗病毒对不同日龄猪的致病性

猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)是可引起仔猪腹泻、肺炎、繁殖障碍和脑脊髓灰质炎等临床症状的肠道病毒,在腹泻猪和无症状的猪中均可检测到,在我国多地流行,给养猪业造成巨大的经济损失。前期本实验室从仔猪腹泻粪便样品中分离到1株PSV,为探究其对不同日龄猪的致病作用,本研究用相同剂量的PSV分别感染3日龄和2月龄猪。结果表明攻毒后24 h, 3日龄猪出现明显的临床症状(水样腹泻、震颤和食欲不振等),2月龄猪无明显的临床症状。攻毒3 d后,对所有猪进行剖检,qRT-PCR结果表明,3日龄猪和2月龄猪粪便中病毒含量均在攻毒后48 h到达顶峰,且PSV在3日龄和2月龄猪体内均具有广泛的组织嗜性。组织病理学检查结果表明PSV感染3日龄猪只后,可引起明显的肠道病理变化,主要表现为肠绒毛萎缩、脱落等,而2月龄猪肠道无明显的病理变化。综上所述,PSV可感染3日龄和2月龄猪,且可以在体内高效复制,但仅引起3日龄猪发生明显的临床症状,对2月龄猪无明显的致病性。     

PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染猪体内各器官组织的分布,用PRRSV SC-1株人工感染健康断奶仔猪,接毒后23 d,无菌采集试验猪器官组织,用RT-PCR检测其中病毒核酸分布情况。结果显示,心脏、脾脏、肺脏、肾脏、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、髂内淋巴结内有病毒核酸,在所有试验猪的肺脏、腹股沟淋巴结都检测到了病毒核酸。本研究结果为PRRS诊断及病毒分离鉴定提供了一定参考依据。     

华东部分地区猪群中猪萨佩罗病毒分子流行病学调查

为了解华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)感染流行情况,通过RT-PCR方法对该地区15个规模化养猪场960份猪粪便样本进行了检测.结果表明,所检测的15个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为17.2％,其中10周龄～20周龄的猪PSV最易感.进一步系统进化分析表明,所检阳性毒株同源性较高,不同地区的毒株交错分布在一起,不存在明显的地区差异,但大体可分为3个亚群,而且已有的国外PSV株均包括在这3个亚群中,这提示PSV可能至少存在3种不同的抗原亚型.     

猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。     

应用原位杂交技术研究母源抗体对PRRS病毒在体内增殖的影响

挑选母源抗体阳性及母源抗体阴性仔猪各2头,人工感染PRRSV,感染后不同时间采集扁桃体、胸腺、脑、肺脏、肩前淋巴结、脾脏、肝脏等组织做成多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片。应用针对PRRS病毒（PRRSV）基因ORF6片段的特异性探针进行原位杂交检测,结果表明,2头母源抗体阴性猪的组织中均可检出病毒阳性信号,而2头母源抗体阳性猪仅可在少数组织中检出病毒阳性信号。以上结果表明,母源抗体会影响同种病毒在体内的增殖。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

基于RNAscope~?原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析

为扩大RNAscope~?原位杂交技术(RNAscope~?ISH)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基础研究中的应用范围,本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合,通过条件优化建立了RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术。经检测不同病毒感染的组织切片中的PRRSV表明该技术具有良好的特异性。采用该双重染色技术检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中巨噬细胞感染PRRSV情况,结果显示PRRSV核酸主要存在于巨噬细胞胞浆中,在胞核中也有分布,但在一些非巨噬细胞中也散在PRRSV阳性信号,表明PRRSV不仅在猪淋巴结巨噬细胞中复制。利用该双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡相关调节基因Bid、Bcl-xl表达水平,结果显示一段时间内Bid基因转录水平上调、Bcl-xl基因转录水平下调,与同条件下荧光定量PCR结果一致。综上,本研究建立的RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术结合了RNAscope~?ISH与IHC各自的优势,不仅能够检测病毒感染后在组织中的定位,还可以分析病毒感染后宿主内源性基因转录的变化趋势,实现了在同一组织切片中对核酸与蛋白的双重检测。经验证该检测方法适用于PRRSV实验室研究,为PRRSV的相关基础研究提供新的检测手段。     

荧光定量RT-PCR对猪流行性腹泻病毒在仔猪体内分布规律的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)在感染仔猪各主要器官中的增殖和分布情况,本研究根据PEDV N基因和宿主细胞GAPDH基因建立荧光定量RT-PCR法,并以该方法检测各个发病期的哺乳仔猪各器官内PEDV的病毒载量。结果表明,仔猪感染PEDV后,在49 h~72 h出现典型的猪流行性腹泻症状,肠、肠系膜淋巴结、肺等器官出现严重病变。利用本研究建立的检测方法在仔猪体内肠、肠系膜淋巴结、肺、脾、肾、心、肝这些器官中均可以检测到PEDV;其中肠、肠系膜淋巴结、肺中病毒载量最高,而且感染时间早、持续时间长。研究表明,PEDV的感染呈持续性、多脏器性,并对肠和肺有组织嗜性;结合本实验室前期的病理研究,推测其在消化器官、呼吸器官中增殖能够导致功能细胞的损伤,在免疫器官的增殖能够造成免疫抑制和混合感染。本研究为PEDV的感染特性、定植规律和致病机理的研究及分子生物学检测方法的建立奠定了基础。     

类猪圆环病毒因子P1在自然感染仔猪体内的组织分布

选用3头自然感染仔猪和1头阴性对照猪,剖杀后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、空肠、扁桃体、胸腺、淋巴结、膀胱、性腺等组织,用荧光定量PCR方法检测病毒在组织中的分布及病毒载量.结果显示,类猪圆环病毒因子P1分布在仔猪的心脏、肝脏、肺脏、胰脏、脑和膀胱等组织,病毒载量以胰脏、脑和膀胱为最高,可达105拷贝/g以上；对照猪脏器中没有检测到病毒核酸.该研究为P1的诊断及致病机制奠定了基础.     

免疫组化法检测猪圆环病毒2型在人工感染猪体内的分布

将猪圆环病毒2型（PCV2）BF株经滴鼻接种28日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间剖杀,采集相关的器官组织制备组织切片,使用免疫组化方法检测病毒在猪体内的分布。结果显示,淋巴结、脾脏、扁桃体等淋巴组织均出现阳性信号,心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑同样存在阳性细胞,其他组织呈阴性反应。阳性信号主要位于感染细胞的胞质中,偶尔出现在细胞核内。结果表明,PCV2确已造成猪体组织感染。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测方法的建立

参照GenBank发表的PCV2ORFl基因序列设计了1对引物,利用PCR地高辛探针合成的方法制备了长度为494bp的特异性探针,经检验具有良好的特异性和敏感性,可检测最低质粒DNA质量浓度为0．9728ug／L。用该探针建立了原位杂交组织切片检测方法,并用来检测PCV2感染猪的扁桃体和淋巴结组织,结果表明阳性信号主要存在于巨噬细胞胞浆中,信号强、背景良好,阴性对照无显色,说明该方法可作为PCV2实验室诊断和机理研究的一种有效检测方法。     

猪圆环病毒病的流行病学调查及其防治

导读：猪圆环病毒病是由圆环病毒引起猪一种新的传染病。主要感染仔猪,临诊类型较多,其特征为体重下降,消瘦、呼吸困难。猪群感染率高,仔猪病死率高。目前,国内疫情情况是继猪蓝耳病之后又突出出来的一个重要猪病,在一些地区其严重性已超过了猪瘟的危害。确诊依赖于病毒抗原检测和病毒抗体的检测。病毒抗原检测技术：采用的方法有间接免疫荧光技术、核酸探针及原位杂交技术和聚合酶链诊断技术;病毒抗体的检测技术有酶联免疫吸附试验等,除此,尚有分子生物学技术。这些诊断方法中以聚合酶链诊断方法应用较多。对于猪圆环病毒病尚无特异的预防措施,加强常规饲养管理,提高营养水平,注意环境卫生及消毒制度,实行全进全出制度。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...