延边黄牛ASB12基因的序列分析及组织表达分析

为了分析ASB12基因在牛生长发育中的作用,试验以延边黄牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆ASB12基因的编码区序列及部分基因组序列,利用生物信息学方法对ASB12基因进行分析,同时采用半定量方法检测ASB12基因在不同组织的表达情况。结果表明:所克隆的牛ASB12基因编码区序列长度为1 055 bp,部分基因组序列长度为1 598 bp(Gen Bank登录号为HQ608159),包含1个内含子。生物信息学分析显示,该蛋白可能存在3个N-糖基化位点,3个豆蔻酰化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点;存在1个保守的结构域,与蛋白ANK具有较高的同源性。组织表达谱分析显示,牛ASB12基因在肌肉等多种组织中均有表达。     

延边黄牛GHR基因第9外显子多态性分析

生长激素受体(GHR)是一种跨膜糖蛋白,是细胞因子/造血因子受体超家族的成员之一,大约由620个氨基酸组成,不同物种氨基酸的数目有所不同。多数动物的GHR分子质量在100～130 ku之间。起初人们认为富含GHR的组织是肝脏,随着辐     

延边黄牛DGATs基因克隆、生物信息学及组织表达分析

试验旨在克隆延边黄牛二酯酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGATs）两种亚型（DGAT1和DGAT2）的CDS区核苷酸序列,并根据生物信息学对两种亚型的氨基酸序列进行分析,以及探讨其在延边黄牛各组织中的表达规律。采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分别进行DGATs基因CDS区的扩增、克隆以及其在延边黄牛8个组织中mRNA表达量的检测,利用NCBI中BLAST将其与其他物种进行相似性分析,并构建系统进化树;通过在线工具对其编码蛋白的理化性质、一级结构及高级结构进行预测。结果显示,DGAT1和DGAT2基因CDS区序列长度分别为1 470和1 086 bp,分别编码489和361个氨基酸;二者均为稳定的疏水性蛋白。DGAT1存在25个潜在的磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个跨膜结构域;DGAT2存在28个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和1个跨膜结构域。二者均不存在信号肽,即不属于分泌蛋白。DGAT1主要是通过α-螺旋和无规则卷曲连接,而DGAT2以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链连接为主。延边黄牛DGAT1和DGAT2基因分别在延边黄牛小肠和脂肪组织中表达量最高,且显著高于其他组织（P<0.05）。本试验结果对进一步研究延边黄牛DGATs基因以及探究其在脂肪沉积过程中的作用机制具有重要意义。     

延边黄牛ANGPTL4基因组织表达规律与肌内脂肪沉积相关性研究

为分析ANGPTL4基因在延边黄牛各组织中的表达差异,进一步探讨该基因在肌内脂肪沉积中的作用,本实验利用q RT-PCR法比较分析了ANGPTL4基因在延边黄牛7个组织(心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和后腿肌)中的表达水平及其与肌内脂肪沉积的相关性。结果表明:ANGPTL4基因在7个组织中表达水平从高到低依次为肝、肺、肾、心、脾、背最长肌和后腿肌,肝中表达量极显著高于心、脾、肺、肾、后腿肌和背最长肌组织(P0.01),肺中表达量显著高于心、脾、肾、后腿肌和背最长肌组织(P0.05);背最长肌中ANGPTL4基因的表达量与背最长肌的IMF含量呈显著正相关(P0.05),相关系数为0.924;ANGPTL4基因在后腿肌的表达量与后腿肌的IMF含量呈显著正相关(P0.05),相关系数为0.998。结果显示,ANGPTL4基因影响延边黄牛肌内脂肪沉积。     

延边黄牛CAST基因16内含子基因多态性与肉质性状相关性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因多态性主要与肉品嫩度相关,与其他肉质性状相关的报道较少。研究采用PCR-SSCP方法对321头延边黄牛CAST基因16内含子进行SNPs多态性检测,并对该座位基因型多态性与肉质性状进行差异显著性分析。结果表明:延边黄牛该座位具有高多态性;该位点基因型多态性与蒸煮损失、亚麻酸含量及肉色等多种肉质性状相关;该位点与肉品多时间点亮度、红色度、黄色度、彩色度及彩色角都存在相关性,但未表现出普遍规律。研究证明,牛中CAST基因与除肉质嫩度外其他肉质性状存在相关性。     

延边黄牛TG基因多态性与胴体和肉质性状相关性分析

选取105头延边黄牛为研究对象,利用克隆测序的方法寻找延边黄牛甲状腺球蛋白(thyroglobulin,TG)基因多态性,采用PCR-RLFP方法进行多态性检测,并与胴体和肉质性状进行了关联分析。结果表明,在TG基因第48外显子上发现C218T和A430G2个突变位点,其中C218T位点的不同基因型与大理石花纹存在显著相关,CC基因型个体大理石花纹等级显著高于CT型个体(P<0.05)。A430G位点的不同基因型与宰前活重和眼肌面积存在显著相关,GG基因型个体的宰前活重和眼肌面积显著高于AA型和AG型个体(P<0.05)。其他性状在2个位点的不同基因型间差异不显著。因此,C218T和A430G位点可能是影响延边黄牛胴体和肉质性状的分子标记。     

延边黄牛黑皮质素受体-4基因多态性及其与肉质性状的相关性分析

试验旨在探索调控肉牛脂肪沉积的关键基因对肉质性状的影响,筛选影响肉牛育肥性状的候选基因。本研究以157头24月龄、体重相近的延边黄牛为研究对象,利用PCR扩增直接测序的方法,分析了延边黄牛黑皮质素受体-4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因的SNPs及其与肉质性状的相关性。结果发现,延边黄牛MC4R基因在1 069 bp处存在C→G突变,导致L （亮氨酸）转变为V （缬氨酸）,引起蛋白质二级结构在166、243、280位氨基酸处出现α螺旋、β折叠丢失,导致三级结构中β转角的空间位置改变。经关联分析表明,该位点与延边黄牛背膘厚、亮度、黄度都存在不同程度的相关,其中GG基因型背膘厚与屠宰后黄度（3 d）显著高于CC和CG基因型（P＜0.05）;GG、CG基因型屠宰后亮度显著高于CC基因型（P＜0.05）。说明该位点与延边黄牛肉质性状存在显著相关,该突变位点可作为潜在的分子标记。     

延边黄牛脂蛋白脂肪酶基因多态性及其与肉质性状的关联分析

为探究延边黄牛脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase,LPL）基因遗传多态性及其对肉质性状的影响,本试验以80头健康的30月龄延边黄牛背最长肌作为试验材料,运用PCR直接测序法和高分辨率熔解曲线技术（HRM）对LPL基因的SNP位点进行检测,分析了试验群体的遗传效应,并与延边黄牛的肉质性状数据进行关联分析。PCR直接测序结果表明,延边黄牛LPL基因存在2个多态性位点（g.6215 A>G和g.18341 C>T）,其中g.6215 A>G位点表现为2种基因型：AA与AG,优势等位基因为A;g.18341 C>T位点表现为2种基因型：CC和CT,C为优势等位基因;对文献中2个位点的检测结果表明,g.355427 T>A位点表现为2种基因型：AA与AT,A为优势等位基因;c.322 G>A位点的HRM分型结果显示并未分型。这些多态性位点全部呈中度多态（0.25<PIC<0.5）,并处于Hardy-Weinberg平衡状态。HRM分型结果显示,这3个SNPs位点与延边黄牛肉质性状存在显著相关：g.6215 A>G位点与延边黄牛胴体重及脂肪、蛋白、水分含量有显著关联,表现为AG基因型个体胴体重、脂肪含量显著高于AA基因型个体（P<0.05）,AA基因型个体蛋白及水分含量显著高于AG基因型个体（P<0.05）;g.18341 C>T位点与延边黄牛宰前活重、胴体重及背膘厚有显著关联,表现为CT基因型个体这些性状均显著高于CC基因型个体（P<0.05）;g.355427 T>A位点AT基因型个体宰前活重、背膘厚和脂肪含量均高于AA基因型个体（P<0.05）。综上,LPL基因g.6215 A>G、g.18341 C>T和g.355427 T>A位点对延边黄牛的肉质有显著影响,LPL基因可以作为延边黄牛品种选育改良工作的优势候选基因和有效分子标记。     

延边黄牛SCD1基因多态性及其与经济性状的关联分析

本研究旨在探索延边黄牛硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoy-CoA desaturase 1,SCD1）基因多态性及其与经济性状的相关性。以157头36月龄健康无病、体重相近的延边黄牛为研究对象,颈静脉采血提取基因组DNA,根据GenBank中牛SCD1基因序列（登录号：AC_000181.1）,利用Oligo 6.0软件设计特异性引物,应用PCR扩增SCD1全长基因后直接测序,分析其多态位点,并应用生物信息学软件分析其蛋白结构;屠宰前测定活体重、胴体重、屠宰率、背膘厚等胴体性状,屠宰后采集背最长肌,测定眼肌面积、蒸煮损失、滴水损失、嫩度、系水力、pH、脂肪酸含量等肉质性状,并通过一般线性模型分析方法对延边黄牛SCD1基因SNPs与肉质性状的相关性进行了分析。结果发现,延边黄牛SCD1基因846 bp处存在A→G突变（g846 A→G）、1 022 bp处存在C→T突变（g1022 C→T）,其中g1022 C→T突变导致丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,但未引起三级结构改变。关联分析结果表明,g846 A→G多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重、滴水损失及硬脂酸、亚油酸含量存在显著相关（P<0.05）;g1022 C→T多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重及硬脂酸含量存在显著相关（P<0.05）,说明上述2个位点与延边黄牛相关肉质性状存在显著相关,该突变位点可作为潜在的分子标记。     

ASB12基因SNPs位点多态性与延边黄牛生长性状关联分析

为研究延边黄牛细胞因子信号转导相关(ASB12)基因多态性与延边黄牛体尺性状的相关性,以203头同等饲养条件下延边黄牛阉牛为研究对象,采用PCR-RFLP技术检测ASB12基因的SNPs位点,并将其与延边黄牛体尺性状进行关联分析。结果:ASB12基因存在2个突变位点,分别为T709C突变,导致氨基酸Leu→Pro的错义突变;C1039T突变,导致氨基酸Pro→Leu的错义突变。χ~2检验显示,2个突变位点在所检测延边黄牛群体中处于Hard-Weinberg平衡状态(P0.05)。关联分析显示,延边黄牛ASB12基因2个突变位点的不同基因型与体高、体斜长差异显著(P0.05)。将2个突变位点合并基因型分析结果表明,组合AACG基因型个体在体高和体斜长显著高于组合BBGG型个体(P0.05)。初步认为ASB12基因对延边黄牛生长性状的有显著影响,其中组合AACG可能是影响延边黄牛生长性状的最佳基因型组合。     

延边黄牛PRKAG3基因多态性及其与肉质性状的相关分析

采用PCR-SSCP方法对120头延边黄牛PRKAG3基因的多态性进行检测,共发现C6529T、T6605C、A6608G和G6685A4个SNPs;单倍型分析产生4种单倍型H1(CCGA)、H2(CCGG)、H3(TCGA)、H4(TCGG),其中H1为优势单倍型,其频率为0.590。结果表明:单倍型H3与蒸煮损失存在负相关(P0.05);单倍型H1与pH1、pH24呈正相关(P0.05),与L*24值负相关(P0.05);单倍型H4与油酸存在负相关(P0.05),与谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和脯氨酸存在正相关(P0.05)。     

延边黄牛SCD1基因多态性及其与经济性状的关联分析

本研究旨在探索延边黄牛硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoy-CoA desaturase 1,SCD1)基因多态性及其与经济性状的相关性。以157头36月龄健康无病、体重相近的延边黄牛为研究对象,颈静脉采血提取基因组DNA,根据GenBank中牛SCD1基因序列(登录号:AC_000181.1),利用Oligo 6.0软件设计特异性引物,应用PCR扩增SCD1全长基因后直接测序,分析其多态位点,并应用生物信息学软件分析其蛋白结构;屠宰前测定活体重、胴体重、屠宰率、背膘厚等胴体性状,屠宰后采集背最长肌,测定眼肌面积、蒸煮损失、滴水损失、嫩度、系水力、pH、脂肪酸含量等肉质性状,并通过一般线性模型分析方法对延边黄牛SCD1基因SNPs与肉质性状的相关性进行了分析。结果发现,延边黄牛SCD1基因846 bp处存在A→G突变(g846 A→G)、1 022 bp处存在C→T突变(g1022 C→T),其中g1022 C→T突变导致丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V),但未引起三级结构改变。关联分析结果表明,g846 A→G多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重、滴水损失及硬脂酸、亚油酸含量存在显著相关(P0.05);g1022 C→T多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重及硬脂酸含量存在显著相关(P0.05),说明上述2个位点与延边黄牛相关肉质性状存在显著相关,该突变位点可作为潜在的分子标记。     

延边黄牛ME1基因多态性及其与肉质性状的相关性分析

为了探讨延边黄牛苹果酸酶1(ME1)基因多态性及其与肉质性状的相关性,试验选取了100头6月龄健康无疾病延边黄牛,进行PCR扩增、基因多态性分析及肉质性状的测定,分析了延边黄牛ME1基因多态性与肉质性状的相关性。结果表明:在延边黄牛ME1基因中共检测到ME1-1、ME1-2 P1、ME1-2 P2、ME1-2 P3、ME1-8、ME1-10、ME1-14共7个多态性位点,基因型频率和基因频率各不相同;在ME1-1位点上,pH值和屠宰率指标AA、AG基因型与GG基因型相比存在显著差异(P0.05),背膘厚指标AA、GG基因型与AG基因型相比存在显著差异(P0.05);在ME1-2 P1和ME1-2 P2位点上,蒸煮损失指标纯合基因型与杂合基因型相比存在显著差异(P0.05);在ME1-2 P3位点上,蒸煮损失、眼肌面积、肌内脂肪含量指标AA、AC基因型与CC基因型间存在显著差异(P0.05);在ME1-8位点上,背膘厚、眼肌面积和肌内脂肪含量指标纯合基因型与杂合基因型相比存在显著差异(P0.05);在ME1-14位点上,眼肌面积指标CC、CT基因型与TT基因型相比存在显著差异(P0.05)。说明ME1基因多态性与肉质性状间存在显著相关。     

贵州黄牛ANGPTL4基因PCR-RFLP多态性检测

利用PCR-RFLP技术对关岭黄牛和思南黄牛各46个个体的类血管生成素4(ANGPTL4)进行多态性检测。结果表明,ANGPTL4基因的扩增片段大小为260 bp,经限制性内切酶Mlu CI酶切后,产生AA和AB 2种基因型,没有发现BB基因型,不同基因型经测序发现205T→C突变。2种黄牛品种中均是AA基因型占优势,A等位基因频率均大于B等位基因。卡方检测结果表明2种黄牛品种在该酶切位点处于平衡状态(P0.05)。     

延边黄牛PRKAG3基因的多态性及其与肉质性状的相关性分析

为了对延边黄牛屠宰后进行肉质性状测定,试验选取30头延边黄牛的全血为试验材料,采用氯化钠法提取DNA,采用PCR-SSCP技术分析PRKAG3基因在延边黄牛中的多态性。结果表明:在全长289 bp的DNA序列中,发现有3处发生了单核苷酸变异,分别是C-T、G-T和A-C,形成AA、CC、AC 3种基因型。PRKAG3基因P3和P9位点多态性与延边黄牛的肉质性状进行分析,引物P3位点多态性与肉质pH值存在极显著相关(P0.01),与剪切力存在显著相关(P0.05);引物P9位点多态性与肉质pH值存在显著相关(P0.05)。说明PRKAG3基因可以作为延边黄牛肉质的候选基因。     

肌联蛋白基因SNPs位点多态性与延边黄牛生长性状间的关联分析

为了研究延边黄牛肌联蛋白(Titin,TTN)基因的多态性对延边黄牛生长性状的影响,选取208头健康的32月龄延边黄牛,利用PCRRFLP和PCR-SSCP方法进行TTN基因遗传变异检测。结果表明:延边黄牛TTN基因存在2个突变位点,分别为A47751G突变,导致氨基酸Ile→Val的错义突变,C73301A同义突变;χ2检验显示,2个突变位点在所检测延边黄牛群体中处于Hard-Weinberg平衡状态(P005);关联分析显示,延边黄牛TTN基因2个突变位点的不同基因型与体高、体斜长、胸围和尻长上差异显著(P005)。将2个突变位点合并基因型分析结果表明,组合AACC基因型个体在体高和体斜长显著高于AATT型个体(P005),初步认为TTN基因对延边黄牛生长性状的有显著影响,其中组合AACC可能是影响延边黄牛生长性状的最佳基因型组合。     

延边黄牛PLIN基因多态性及其与胴体和肉质性状的相关性分析

为探究延边黄牛脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN）基因遗传多态性及其对胴体和肉质性状的影响,试验选取70头30月龄健康延边黄牛公牛,采集颈静脉血液及其12~13肋间背最长肌以提取延边黄牛DNA样本,并测定胴体与肉质性状,采用直接测序方法检测PLIN基因SNP位点,结合延边黄牛胴体、肉质数据与PLIN基因遗传多态性进行关联分析。结果显示,在延边黄牛PLIN基因外显子3 103与156 bp处存在2个突变位点：g.103 C→T和g.156 T→C,均为错义突变。g.103 C→T位点存在CC、CT两种基因型,CC基因型为优势基因型（0.81）,C基因为优势等位基因（0.90）,表现为CT基因型个体脂肪含量、宰前重、胴体重、背膘厚均显著高于CC基因型个体（P<0.05）;g.156 T→C位点存在TC、TT两种基因型,TT基因型为优势基因型（0.83）,T基因为优势等位基因（0.92）,表现为TC基因型个体的宰前重、胴体重及背膘厚均显著高于TT基因型个体（P<0.05）。卡方检验结果表明,延边黄牛在PLIN基因外显子3的2个SNPs位点均达到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,杂合度较低,属于低度多态（PIC<0.25）。综上,PLIN基因g.103 C→T和g.156 T→C位点对延边黄牛部分胴体与肉质性状存在一定影响,该位点可作为延边黄牛胴体、肉质性状的潜在标记,PLIN基因可以作为延边黄牛品种选育的候选基因和潜在分子标记。     

延边黄牛FGF14基因多态性及其对生长性状的影响

本研究旨在探索延边黄牛成纤维细胞生长因子14（fibroblast growth factor 14,FGF14）第3外显子多态性及其对生长性状的影响。应用DNA直接测序法对延边黄牛FGF14基因第3外显子进行测序分析,利用高分辨率熔解曲线HRM分型技术对FGF14基因进行分型检测,探究FGF14基因不同基因型与16和24月龄延边黄牛生长性状的关联性,并进行遗传统计学分析。结果显示,在FGF14基因的631 947 bp处检测到1处A>G突变,有2个等位基因：A和G,存在3种基因型：AA、AG和GG。χ²检验结果表明,FGF14基因的基因型频率和等位基因频率在16和24月龄延边黄牛群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。多态信息含量（PIC）分析表明,FGF14基因在这2个群体中均处于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。与生长性状关联分析结果显示,FGF14基因不同基因型对16月龄延边黄牛背高和尻长均具有显著影响（P<0.05）,对24月龄延边黄牛体高、体重、十字部高均具有显著影响（P<0.05）。综上所述,推测FGF14基因对延边黄牛生长发育有一定影响,为后续延边黄牛肉质性状的现代分子育种选育工作提供参考。