环形泰勒虫TRAP-A蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。     

牛源犬新孢子虫NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象。结果显示:本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-AMA1,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活。结果表明:诱饵载体pGBKT7-AMA1可用于酵母双杂交系统筛选与虫体互作的宿主蛋白。     

鹅细小病毒VP2和VP3蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。     

小反刍兽疫病毒酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-tH的构建、表达和鉴定

利用PCR技术扩增获得PPRV-tH基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切、测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109中,检测其在酵母中有无渗漏、自我激活作用和毒性。利用Western blotting分析诱饵蛋白在酵母中的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果表明,成功扩增到了PPRV-tH,并正确构建了pGBKT7-tH诱饵表达载体,此载体在酵母细胞AH109中无毒性、渗漏和自我激活能力,且能正确表达tH蛋白。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

酵母双杂交诱饵蛋白日本血吸虫抱雌沟蛋白重组质粒的构建及鉴定

为筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的因子,本研究以抱雌沟蛋白（gynecophoral canal protein ofSchistosoma japonicum,SjGCP）为诱饵蛋白构建了用于酵母双杂交筛选系统的重组质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列设计引物,经过PCR扩增、酶切回收,与经相应酶切的线性化载体pBGKT7-BD连接构建重组质粒。随后将重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP转化酵母菌株,测定融合蛋白BD-SjGCP在酵母菌中的自激活活性、对酵母菌生长的影响及在酵母中的表达情况。结果显示构建的重组诱饵蛋白质粒pGBKT7-BD-SjGCP能够在酵母细胞内正确表达,没有独自激活报告基因表达的活性,且其表达对酵母细胞没有毒性,不影响酵母细胞的生长。可见,重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP可用于筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的物质。     

鸭肠炎病毒UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为构建DEV UL24/C蛋白的酵母双杂交的诱饵载体,本研究以DEV CHv株基因组DNA为模板,经一步法克隆构建pGBKT7-UL24/C诱饵质粒,质粒转化酵母菌株后进行自激活活性检测、免疫印迹检测和毒性检测。结果显示,诱饵质粒pGBKT7-UL24/C插入片段大小为510 bp,且未发生基因突变;pGBKT7-UL24/C质粒转化Y2HGold菌株后的自激活检测显示诱饵菌株无自激活活性,免疫印迹检测表明该诱饵菌株成功表达DEV UL24/C蛋白,毒性检测表明该诱饵蛋白对宿主菌Y2HGold无毒性作用。综上表明,未研究正确构建了UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体Y2HGold(pGBKT7-UL24/C),为筛选与DEV UL24蛋白相互作用蛋白、探究DEV UL24蛋白功能及分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。