凋亡和ERK信号在镉诱导神经细胞自噬中的作用

为了探讨凋亡和ERK信号与镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞自噬的关系,本研究用20μmol/L镉作用大鼠大脑皮质神经细胞4h,免疫荧光观察自噬小体,吖啶橙染色观察酸性自噬泡的形成;20μmol/L镉单独或联合氯喹作用4h、联合雷帕霉素或caspase抑制剂Z-VAD-fmk作用24h,DAPI荧光染色观察细胞核的变化;20μmol/L镉联合ERK抑制剂U0126作用4h,免疫印迹检测ERK、LC3的表达变化。结果表明:镉处理4h,大脑皮质神经细胞发生明显的聚点现象,吖啶橙染色可见酸性自噬泡的形成;与正常组比较,镉处理24h后神经细胞出现染色质固缩、核碎裂;镉联合氯喹作用4h,损伤的神经细胞增多,出现新月状、浓缩的胞核,甚至出现核碎裂;而镉联合雷帕霉素或ZVAD-fmk组,细胞的损伤明显减轻。U0126能明显抑制原代神经细胞ERK1/2的磷酸化水平,同时还能显著抑制LC3-II的表达(P0.05)。说明镉诱导的自噬可以延迟凋亡的发生;ERK是自噬的上游信号分子,它的激活有利于诱导自噬。     

自噬在镉致大鼠大脑皮质神经细胞损伤中的作用

以大鼠原代大脑皮质神经细胞为模型,以不同浓度（0、1、2.5、5、10μmol/L）的镉（Cd）染毒,免疫荧光观察自噬小体,Western-blotting检测细胞LC3蛋白表达水平,并检测了自噬特异性阻断剂羟氯喹（CQ）作用后细胞活性和酸性自噬泡的变化。结果显示,Cd可促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,10μmol/L Cd作用4h,LC3-Ⅱ表达水平达到最高,神经细胞发生明显的聚点现象;CQ能明显降低自噬水平,抑制自噬,细胞活性明显降低。表明Cd能诱导大鼠原代大脑皮质神经细胞发生自噬,自噬在Cd引起的神经细胞损伤中起保护作用。     

自噬在玉米赤霉烯酮诱导TM4细胞凋亡中的作用

为探讨自噬在玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导睾丸支持细胞株TM4凋亡中的作用,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理细胞24 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Bax等凋亡相关蛋白的表达情况;同时检测20μmol/L ZEA联合自噬抑制剂氯喹(CQ)或促进剂雷帕霉素(RAP)后对TM4细胞凋亡率和凋亡相关蛋白及自噬关键蛋白LC-3的变化。结果显示:与对照组相比,5μmol/L ZEA以上染毒组Bax/Bcl-2的比值、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表达量均显著或极显著增加。20μmol/LZEA+c Q可使ZEA诱导的TM4细胞的凋亡率上升,Bax/Bcl-2的比率以及cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达显著下降而自噬标志蛋白LC-3的表达上升;20μmol/LZEA+RAP,可使ZEA诱导的TM4细胞的凋亡率下降;Bax/Bcl-2的比率,cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表达及LC-3的表达显著上升。结果表明:在ZEA诱导的TM4细胞发生凋亡的过程中,细胞凋亡率与自噬水平的高低有明显的关系,抑制自噬,ZEA诱导的TM4细胞凋亡率明显升高;促进自噬,ZEA诱导的TM4细胞凋亡率明显降低。研究表明,自噬能够延迟TM4细胞发生凋亡,自噬在ZEA对TM4细胞的毒性损伤中发挥保护作用。     

敌百虫和伊维菌素对近邻剑水蚤的急性毒性

鱼苗孵化用水经常会滋生桡足类,严重影响育苗的成活率。本文通过水生生物急性毒性试验方法,研究敌百虫和伊维菌素对淡水常见桡足类近邻剑水蚤（Cyclops vicinus）的急性毒性。根据预试验的结果,敌百虫浓度梯度设置为0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 mg/L,伊维菌素浓度梯度设置为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/L。每个浓度组设置3个平行,每个平行放10只桡足类,试验在20℃光照培养箱中进行。结果表明,敌百虫对桡足类的24 h LC50和48 h LC50分别为1.862、1.183 mg/L,而伊维菌素对桡足类的24 h LC50和48 h LC50分别为0.404μg/L、0.1644μg/L。伊维菌素的毒性远远大于敌百虫,生产上选用伊维菌素效果更好。与此同时,敌百虫和伊维菌素对桡足类的安全浓度分别为0.1432 mg/L、0.00816μg/L,可以为生物监测环境农药污染提供重要依据。     

顺铂诱导体外犬乳腺肿瘤细胞凋亡影响

为研究顺铂诱导体外犬乳腺肿瘤细胞CHMp凋亡影响,本试验采用不同浓度的顺铂以不同作用时间处理细胞,用MTT法检测细胞活性,通过透射电镜观察CHMp细胞形态学变化,用流式细胞仪研究CHMp细胞凋亡和周期。结果显示,CHMp细胞生长受浓度和时间双重依赖,浓度越高,时间越长,抑制越明显,在电镜下观察细胞出现明显的凋亡形态,同时5μmol/L顺铂作用24 h后细胞阻滞于G1/S期,比例高达75.12%。结果表明,顺铂能抑制CHMp增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞G1/S期。     

姜黄素通过激活自噬影响猪前体脂肪细胞脂质沉积的研究

为了探讨姜黄素处理对猪前体脂肪细胞脂质沉积的影响及其自噬激活机制在其中所起的作用,采用断奶仔猪皮下脂肪分离获得前体脂肪细胞,增殖培养至85%~95%融合,利用终浓度为0.1 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.25μmol/L地塞米松(DEX)、5μg/m L胰岛素(Insulin)的诱导分化液诱导分化,同时给予姜黄素处理,随机分为2组:对照组(诱导分化液+姜黄素溶解试剂DMSO)和处理组(诱导分化液+10μmol/L姜黄素),48 h后收集细胞进行分析。结果显示:与对照组细胞相比,10μmol/L姜黄素处理对细胞增殖能力没有明显影响(P=0.82),但能极显著降低脂肪细胞中甘油三酯(TG)的沉积量(P0.01);与对照组相比,10μmol/L姜黄素处理能极显著增加自噬标志基因(LC3)和溶酶体酸性脂肪酶(Lipa)mRNA的表达(P0.01);Western blot显示,10μmol/L姜黄素处理能显著增加LC3的表达(P0.05),并促进LC3-I向LC3-II的转化。结果表明:姜黄素处理能显著抑制猪脂肪细胞脂质沉积,该过程可能是通过自噬激活机制来实现的,研究结果为畜牧兽医生产中姜黄素的应用提供理论支持。     

自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)雄性生殖毒性的机理,本试验展开了ZEA对睾丸支持细胞细胞周期的影响以及自噬在ZEA对睾丸支持细胞细胞周期影响中的作用研究。试验以原代睾丸支持细胞为材料,分别以浓度为0(对照组),0.1,1,10,20,30μmol/L ZEA进行染毒,24h后利用CCK-8法、流式细胞术、免疫荧光技术和Western blot等进行ZEA对睾丸支持细胞的活率、细胞周期分布、LC3聚点、自噬及细胞周期相关蛋白等影响的检测。流式细胞术检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,G0/G1期比例显著下降(P<0.05),G2/M期的比例极显著升高(P<0.01);与20μmol/L ZEA组相比,自噬抑制剂(CQ)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著降低(P<0.05),自噬促进剂(RAP)+20μmol/L ZEA组细胞周期的G2/M期的比例显著升高(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,当ZEA浓度高于10μmol/L时,产生LC3荧光信号的细胞数目较对照组呈极显著性升高(P<0.01)。Western blot检测结果显示:与对照组比较,当ZEA浓度高于10μmol/L时,LC3蛋白的表达量呈极显著性升高(P<0.01),CDK4、CyclinD1等细胞周期蛋白的表达显著降低(P<0.05);与20μmol/L ZEA组相比,CQ+20μmol/L ZEA组CyclinD1、CDK4等蛋白的表达量上升(P<0.05),RAP+20μmol/LZEA组CyclinD1、CDK4等的表达量下降(P<0.05)。结果表明:ZEA能诱导睾丸支持细胞发生自噬,并使睾丸支持细胞发生G2/M期阻滞,且存在剂量依赖性;促进自噬可导致细胞周期阻滞在G2/M期,造成M期延长,而自噬的缺陷可以部分逆转ZEA诱导睾丸支持细胞周期G2/M期的阻滞。在一定浓度范围内,ZEA能显著抑制睾丸支持细胞的增殖,细胞自噬在这一过程中起促进作用。     

新城疫病毒疫苗株F蛋白裂解位点改造对诱导HepG2细胞发生自噬的影响

新城疫病毒(NDV)通过启动不依赖p53的内源性凋亡通路特异性诱导肿瘤细胞凋亡.最新研究表明NDV可以引起U251肿瘤细胞发生自噬,并在后期导致细胞凋亡,但其机理尚不清楚.本研究通过反向遗传操作技术对NDV Clone30疫苗株F蛋白的碱性裂解位点进行突变,将F蛋白的裂解位点由弱毒株的GGRQGR ↓ L突变为强毒株的GRRQRR ↓ F基序,并成功拯救出突变改造病毒rC30-FmF.分别将Clone30野生型病毒株rC30-wt与rC30-FmF感染HepG2肝癌细胞,通过透射电镜检测细胞超微结构显示,rC30-FmF感染4h后细胞内出现大量自噬小体及自噬溶酶体.通过westem blot检测自噬标志蛋白LC-3 Ⅱ表明,rC30-FmF感染4h后LC3Ⅱ表达量显著上调,与rC30-wt对照组相比差异极显著(p＜0.01).研究表明,rC30-FmF可以在感染早期增加HepG2细胞自噬程度.从而初步证明F蛋白的裂解位点在诱导HepG2细胞自噬过程中具有关键作用.     

紫杉醇和姜黄素联合使用的体内外抗乳腺肿瘤效果

为了探究紫杉醇(TAX)、姜黄素(CUR)联合使用在体内、体外抗乳腺肿瘤的作用,本试验采用CCK-8法测定TAX、CUR单体及二者联合使用对犬乳腺肿瘤细胞系7364的细胞增殖抑制率;将荷瘤小鼠随机分为生理盐水组、TAX组、TAX+CUR组,考察TAX、CUR联合使用对小鼠乳腺肿瘤细胞系(4T1)皮下移植瘤模型的抑瘤药效。体外试验结果显示,TAX单体药物对犬乳腺肿瘤细胞系7364的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.191μmol/L,CUR单体药物IC₅₀为53.160μmol/L,CUR(0.25～2μmol/L)和TAX(0.013～0.4μmol/L)联合给药时TAX IC₅₀与其单独给药相比显著降低,表明TAX和CUR在一定比例、浓度时具有协同抗肿瘤效应。动物试验结果显示,TAX+CUR组初次给药后第11天肿瘤体积显著低于生理盐水组(P<0.05);治疗结束后完整剥离肿瘤,测得TAX+CUR组的抑瘤率为17.3%,而TAX组无明显抑瘤效果。结果表明TAX和CUR在一定配比、浓度条件下对犬乳腺肿瘤细胞系7364具有...     

猪瘟病毒诱导细胞自噬有利于病毒复制

首先采用蛋白印迹以及激光共聚焦显微观察的方法,研究猪瘟病毒感染对细胞内自噬相关蛋白LC3表达及定位的影响;然后用自噬诱导剂雷帕霉素或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理猪肾细胞,通过病毒滴度测定研究细胞自噬对病毒复制的影响。发现在病毒感染24h后自噬相关蛋白LC3由LC3-Ⅰ酯化为LC3-Ⅱ,并观察到病毒感染的细胞中出现了LC3蛋白聚点;细胞自噬体的诱导能显著增加病毒滴度。本研究表明猪瘟病毒在感染细胞后能诱导细胞自噬,该细胞自噬过程有利于病毒的增殖。