Mrhox3影响罗伯茨绿僵菌产孢和抗逆能力的研究

罗伯茨绿僵菌作为一种昆虫病原真菌,已在害虫生物防治中得到应用。Homeobox家族基因在真菌无性繁殖过程中具有重要作用,但是其在昆虫病原真菌中的功能尚不清楚。qRT-PCR结果显示homeobox家族基因Mrhox3在产孢阶段和分生孢子阶段高水平表达。通过基因敲除与回补研究其功能,结果表明敲除Mrhox3不影响菌株营养生长和致病性,但是显著降低菌株的产孢能力。进一步研究显示敲除Mrhox3显著下调关键调控因子abaA和wetA等多个产孢相关基因的表达水平。敲除Mrhox3促进分生孢子萌发,并显著增强分生孢子对紫外胁迫和热激胁迫的耐受力。本研究将为进一步揭示罗伯茨绿僵菌的产孢机制和分生孢子抗逆机制奠定基础。     

绿僵菌产孢研究

在ＰＤＡ培养基的基础上，加０．５％的蛋白胨、３．０％的蔗糖是多绿僵菌良好的产孢培养基。５０×１０＾－６的胆矾可显著提高菌株８５５０和３０１０４的产孢量，１００×１０＾－６的胆矾可显著提高８４０１的产孢量。     

虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢、致病力及其相关基因的表达特征

为明确绿僵菌在其致死害虫表面生长发育和致病力等相关分子机制,通过显微观察大蜡螟Galleria mellonella虫尸表面罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii生长和产孢特性,并测定其致病力,分别对虫尸表面和PDA培养基上罗伯茨绿僵菌的菌丝生长阶段和大量产孢阶段进行高通量测序,对虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢及致病力通路相关基因进行系统分析,并采用荧光定量PCR技术对高通量测序结果进行验证。结果表明,PDA培养基上培养5 d后,罗伯茨绿僵菌开始大量产孢,培养14 d时产孢量最高,为4.6×10~7个/cm~2,大蜡螟幼虫注射罗伯茨绿僵菌4 d后,其体表出现菌丝,5.5 d后虫尸表面罗伯茨绿僵菌大量产孢,9 d后产孢量最高,为2.6×10~8个/cm~2。与PDA培养基上罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(7.09 d和4.66 d)相比,体壁侵染法和显微注射法侵染的虫尸表面罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(6.33 d和4.49 d)分别显著缩短和无显著变化。高通量测序结果显示,在菌丝生长阶段和大量产孢时期,虫尸表面罗伯茨绿僵菌中共有810个基因上调表达,452个基因...     

金龟子绿僵菌黏附素基因mad1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT₅₀为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC1、PCD4,抗病基因SWEET10及转录因子WRKY41、MYB86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML5、CML19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些...     

绿僵菌的生物学特征及其致病机理研究进展

综述了绿僵菌的生物学特性及其在昆虫表皮上的附着、入侵并在体内发生一系列生理生化反应的研究情况。     

绿僵菌蝗虫菌株Pr1蛋白酶基因的克隆及序列分析

从绿僵菌蝗虫菌株M2189克隆了昆虫表皮降解酶Pr1的基因。以特异性引物，分别进行了DNA-PCR和mRNA-RT-PCR反应，得到了预期扩增片段，回收纯化后通过pGEM-T载体转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，EcoR Ⅰ酶切鉴定表明目的片段已插入质粒。对重组质粒中插入的DNA片段进行了核苷酸序列测定，表明该序列全长1369bp，其中有3个内含子，分别为76、59、67bp；编码序列长度为1167bp，含有起始密码子和终止密码子，是一个完整的蛋白读码框。与菌株Mel得到的Prl编码序列（GenBank／M73795）相比，二者的核苷酸数目相同，同源性达到92．2％，编码的389个氨基酸中48个不同，占12．3％。     

绿僵菌对暗黑金龟蛴螬的室内致病力测定

从黄褐金龟虫尸分离的绿僵菌菌株（ＲＡＷ８），经室内试验，结果对暗黑金龟幼龄蛴螬致病力强，在每克含孢量２０×１０６～２．５×１０６的土中饲养，致病率均达１００％，孢子浓度降低，致病时间延长，死亡率也减少     

油类和糖类对绿僵菌孢子萌发的影响

在２３－２４℃及保湿条件下培养２４小时，绿僵菌分生孢子在７种植物油油滴上的萌发率在９６％以上。在４种矿物油中，石蜡油、煤油、柴油萌发率达８６％－９９％，但在润滑油中不能发芽。对１５种碳源上观察结果，赤癣糖、麦芽糖、Ｄ－甘露糖、葡萄糖有促进孢子萌发的作用。     

金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响

丝状真菌的fluG基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中fluG的作用鲜有研究报道。本研究利用DNA同源重组方法,构建敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因ben作为筛选标记,fluG基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用PEG介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG突变株继代培养5代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明fluG基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。     

金龟子绿僵菌对石蒜绵粉蚧的室内毒力与防治效果

石蒜绵粉蚧是近年我国新记录的一种有害生物,目前在福建省漳州地区的多肉植物种植基地发生为害严重。为探讨金龟子绿僵菌F061和FM-03对该虫的生防潜力和应用前景,本研究测定这2株菌株对石蒜绵粉蚧的室内毒力和防治效果。结果表明,石蒜绵粉蚧受菌株F061和FM-03侵染10 d后1×10⁸孢子/mL处理浓度的累计校正死亡率分别为83.15%和91.95%;构建的2个TDM模型均通过Pearson卡方和Hosmer-Lemeshow检验,2株菌株对石蒜绵粉蚧的时间-剂量互作效应明显,剂量效应随侵染时间的延长逐渐升高,时间效应随菌液浓度的升高逐渐增强,菌株F061侵染10 d后的LC₅₀和1.00×10⁸孢子/mL处理的LT₅₀分别为5.55×10⁵孢子/mL和5.04 d,而菌株FM-03在同等条件下的LC₅₀和LT₅₀分别为1.11×10⁵孢子/mL和4.67 d,毒力强于菌株F061;此外,2株菌株1.00×10⁸孢子/mL处理浓度对石蒜绵粉蚧的室内防治效果也随试验时间的延长而提高,菌剂F061和FM-03喷施10 d后的室内防治效果分别为74.06%和81.32%。综上,2株菌株均可用于防控多肉植物上的石蒜绵粉蚧,菌株FM-03可优先开发应用,菌株F061可作为备选菌株使用。     

一株金龟子绿僵菌对茶尺蠖的致病力和胞外酶活性

为明确从茶园腐殖层昆虫尸体上分离的虫生真菌的分类地位及其对茶尺蠖的生防潜力,采用形态学特征观察和rDNA?ITS序列分析方法对该菌株进行鉴定,并测定该菌株对茶尺蠖4龄幼虫的毒力及其胞外酶活性.结果表明,从茶园腐殖层虫尸上分离获得一株金龟子绿僵菌CHMA?005;该菌株侵染茶尺蠖4龄幼虫10 d后,致死率、LC50和LT...     

不同菌株绿僵菌和白僵菌对刚竹毒蛾幼虫致病力及林间防治试验

刚竹毒蛾(Pantana phyllostachysae Chao)是福建省毛竹林的一种主要害虫,本研究应用5种金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株和1种白僵菌(Beauveria bassiana)菌株,对3龄初幼虫进行感染力测定,旨在筛选出感染该虫的高致病力菌株。结果表明:应用1.45×10 7孢子/mL孢悬液感染12 d后,3龄初幼虫的校正死亡率均达到63.16%以上;其中MaFzzL-01和Ma1291-2两个绿僵菌株对该幼虫的致病力分别为90.93%和84.21%,其LT50值分别为5.97 d和6.67 d,LC50值分别为1.727×10 4孢子/mL和2.029×10 4孢子/mL。结果说明:绿僵菌MaFzzL-01和Ma1291-2两个菌株对该幼虫的致病力强,且致死速度快。应用1.45×10 8孢子/mL孢悬液进行林间防治可以取得良好效果。     

安徽大别山区绿僵菌属物种多样性

绿僵菌是一类常见且极具应用价值的生物防治材料。目前绿僵菌分类系统取得了突破性的进展,然而新分类系统在国内尚未普遍采用。本文用该系统研究了近年来分离自大别山区僵虫的21株绿僵菌的物种多样性。在对大别山绿僵菌菌株的形态学研究基础上;对其转录延长因子（EF-1a）进行了进一步的PCR扩增、测序和同源性分析,并选用MEGA软件依据简约法构建EF-1a系统发育树。结果表明,21株菌株在新系统中分别属于5个种,即贵州绿僵菌、大孢绿僵菌、蚱蜢绿僵菌、黄绿绿僵菌瘿绵蚜变种和棕色绿僵菌,并对中国新纪录棕色绿僵菌进行了形态学的描述。该研究基本明确了大别山区的绿僵菌物种多样性,为生物防治菌株提供了科学鉴定方法和丰富种质资源。     

丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin1对绿僵菌侵染飞蝗的影响

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）是昆虫体内一类非常重要的蛋白酶抑制剂,具有调节昆虫免疫反应的功能。为研究Serpin1对绿僵菌Metarhizium anisopliae侵染飞蝗Locusta migratoria的影响,从飞蝗体内克隆了serpin1基因,经原核表达获得Serpin1蛋白;以飞蝗为试虫,通过饵剂饲喂的方法,测定了Serpin1蛋白对绿僵菌菌株IMI330189毒力的影响,并检测了绿僵菌IMI330189单独处理、Serpin1单独处理、绿僵菌IMI330189与Serpin1混合处理情况下飞蝗体内保护酶POD和SOD的活力。结果表明,在Serpin1与绿僵菌IMI330189混合饲喂3 d后,飞蝗的累计死亡率开始低于绿僵菌单独处理;到第8 d,绿僵菌IMI330189单独处理飞蝗累计死亡率达到100%,而Serpin1与绿僵菌IMI330189混合处理累计死亡率为84.31%,两者之间差异显著。POD和SOD酶活力测定结果显示,绿僵菌IMI330189单独处理时飞蝗体内的POD活力在第2 d和第3 d较对照组显著升高,而在第5 d较对照组显著下降;绿僵菌IMI330189与Serpin1混合处理后飞蝗体内的POD活力在第3 d和第5 d较对照组和绿僵菌处理组显著升高,而在第1 d显著低于对照组和绿僵菌处理组。绿僵菌IMI330189单独处理及绿僵菌IMI330189与Serpin1混合处理时,飞蝗体内的SOD活力在第1 d、第3 d和第5 d较对照组显著升高,在第2 d时较对照显著降低,且绿僵菌IMI330189与Serpin1混合处理组在第2 d和第3 d时较绿僵菌IMI330189单独处理组显著升高。上述研究结果表明Serpin1能够通过调节飞蝗体内POD和SOD的活性,有效抑制绿僵菌IMI330189对飞蝗的侵染。本研究为揭示Serpin1的生理功能奠定了基础。     

用gfp基因标记法研究金龟子绿僵菌在玉米根际的定殖动态

利用草胺磷抗性基因bar为筛选标记,将绿色荧光蛋白基因（gfp）转入载体pbarGPE1,得到了组成性表达载体pGPE-GFP,并转入金龟子绿僵菌RCEF3377,获成功表达。用含有gfp基因的金龟子绿僵菌孢子粉配制种衣剂,对玉米种子包衣。于玉米苗期对根际定殖情况进行定期取样观测。结果表明,与非根际土壤相比,在根际土壤中被标记的绿僵菌带菌量不仅最大,而且在播种后10d数量达最大,20～30d内数量即不再显著变动。相比之下,非根际土壤中的带菌量不仅极显著少于根际土壤,且随时间的延长明显降低;在表层土中的带菌量很低,亦随时间的延长显著降低。表明应用该种衣剂剂型,金龟子绿僵菌孢子在玉米根际有较高活力和定殖效果。     

田间施放绿僵菌防治稻水象甲效果评价

在稻水象甲成虫怀卵期,田间用绿僵菌（１０＾１４孢子／ｈｍ＾２）喷雾防治,１３天后对成虫的防治效果达９２．５％。经防治后的幼虫和次代成虫平均虫口分别为２．１２和０．３０头／从,而对照分别为８．４０和４．１７头／丛,差异均达极显著（ｔ〉０．０１）。对虫口密度高发地块,若采取菌剂和化学膛药配合使用,效果则更佳。     

绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C诱导飞蝗中肠免疫功能分析

为明确金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae胞外蛋白酶Pr1C在绿僵菌侵染飞蝗Locusta migratoria中肠中的作用,从绿僵菌IMI330189菌株转录组中获得并分析了Pr1C基因全长序列,设计引物对该基因进行了克隆和原核表达。将表达的Pr1C蛋白与绿僵菌IMI330189混合后饲喂处理,测定了混合物对飞蝗的毒力,并通过荧光定量PCR检测了飞蝗中肠免疫相关基因的表达情况。结果显示,该基因属于绿僵菌类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶家族,全长为2126 bp,蛋白大小为71 kDa。Pr1C与绿僵菌IMI330189混合后可以显著提高对飞蝗的毒力。荧光定量结果表明,Defensin,Persephone,Tube,Relish,Dredd 5个基因在各处理中表达量均呈现升高趋势,其中Pr1C蛋白和绿僵菌混合处理的变化比其他处理组变化快,于第2天达到较高水平;绿僵菌处理变化较慢,于第6天达到最高水平。本研究表明,绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C可显著提高绿僵菌毒力,促进绿僵菌侵染速率,为进一步研制和应用生物制剂防治飞蝗提供理论依据。