双叉犀金龟表皮蛋白Td14144表达纯化及性质研究

表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份，在昆虫的生长发育过程中起着重要作用，有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫，且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据，利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因（GenBank登录号：MZ463195），并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族，含有R&R保守结构域；系统进化分析结果表明，Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达，并使用金属螯合层析进行分离纯化，SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化，成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力，发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合，其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。     

亚洲玉米螟表皮蛋白CPR9的表达纯化及与几丁质的相互作用

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫，了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分，因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9是亚洲玉米螟体壁表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CPR9属于CPR家族中RR-1亚家族的表皮蛋白，含有R&R结构域，可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究CPR9与几丁质的相互作用，本研究利用pET-SUMO载体实现了SUMO-CPR9融合蛋白的可溶表达，并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化了CPR9，平均收率为5 mg/L。几丁质结合试验发现，CPR9对不同类型的几丁质的结合具有选择性。CPR9对α-几丁质结合能力很强，对胶体几丁质结合能力较强，但不与β-几丁质结合。脱乙酰几丁质（壳聚糖）结合试验发现，CPR9能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚。圆二色光谱分析表明，CPR9在结合脱乙酰几丁质后，其二级结构中平行β折叠和β转角比例上升，反平行β折叠及无规卷曲比例下降。本研究发现了CPR家族表皮蛋白与不同类型几丁质的结合存在特异性，而且在结合过程中会发生结构变化，有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。     

淡紫拟青霉几丁质酶的纯化和活性影响因子

 淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是一种重要的植物线虫卵寄生真菌。采用DEAE-22离子交换层析和SephcrylS-300凝胶过滤层析分离纯化到一种淡紫拟青霉胞外几丁质酶,经7.5%聚丙烯酰胺凝胶电脉检测为单一条酶带,Rf值等于0.43。淡紫拟青霉几丁质酶的最适温度为45℃。热稳定性测定表明它在40℃下放置10min可保持原有活力,60℃下10min,完全失活。该酶的最适pH值为5。其pH值稳定性与温度和反应时间有关。20℃、20min,在pH3~9范围内稳定;37℃、1h,则只在pH5~7范围内较稳定。金属离子如Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Li⁺和Fe²⁺对酶有一定的激活作用,其中Mg²⁺的激活作用最强。相反,Cu²⁺对酶有强烈抑制作用。     

中华根瘤菌L03几丁质酶纯化及其酶学性质研究

中华根瘤菌Sinorhizobium sp.菌株L03是1株能产生几丁质酶的生防细菌.采用90%饱和度硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等方法获得了菌株L03的几丁质酶.SDS-PAGE检测发现该酶已被纯化,其分子量约为41.3kD.该酶反应的最适温度为45℃;最适反应的溶液pH值为6;酶液在pH5～8条件下和40℃下分别保存1h,酶活力基本保持稳定;Mg2+和Ba2+能显著促进几丁质酶活性上升,而Zn2+、Cu2+和Fe3+等对酶活力有明显的抑制作用.功能分析结果显示,该几丁质酶对供试的几种病原真菌细胞壁都有明显的降解作用.     

昆虫几丁质酶及其应用研究综述

几丁质作为自然界的一种含氮多糖类生物性高分子,是昆虫表皮、中肠围食膜和气管系统的主要结构成分,保护昆虫免受化学侵蚀、物理损伤和病原入侵。昆虫几丁质酶可以降解昆虫体壁和围食膜中的几丁质,近年来受到了越来越多的关注。通过对昆虫几丁质酶的调控,可直接影响其生长发育,实现对害虫的有效防治。本文综述了昆虫几丁质酶结构、体内表达特性、生理功能和影响因素,及其在害虫防治中的应用与存在的不足,旨在为昆虫几丁质酶在植物保护领域更深入的开发应用提供科学依据。     

内生菌螺旋毛壳抗生素和水解酶的协同抗真菌作用

 生防因子螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35生长于含立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝细胞壁制备物的SM培养基中,从培养滤液提取的粗酶液强烈抑制Valsa sordida、Valsa mali、Glomerella cingulata和Curvulavia lunata病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。经DNS法检测,粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶(包括内切和外切酶)和几丁质酶活性,分别为0.19 U.mg-1和0.09 U.mg-1。生长于3%玉米粉浸渍液的螺旋毛壳ND35的培养滤液也能抑制上述病原菌的菌丝生长和孢子萌发。离体条件下检测了ND35产生的一纯化的具有分子量为73 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶(GLUC73)和一纯化的抗生素对苹果炭疽病菌的分生孢子萌发和芽管延长的抑制效果。当内切β-1,3-葡聚糖酶使用浓度为180 μg·mL^-1时,抑制了测试真菌的孢子萌发,造成细胞壁的改变,导致了菌丝顶端的破裂;抗生素的有效抑菌中浓度ED₅₀为1.75 μg·mL^-1。单独应用时,1.0 μg·mL^-1的抗生素或40 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶没有或仅有很低的抑菌效果;两者组合导致孢子萌发约78%受抑制。甚至10 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶也使1.5 μg·mL^-1抗生素的抑菌作用从低于25%增加到超过50%的抑菌效果。此外,80 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶使1.0 μg·mL^-1抗生素的抑菌活性从0%提高到90%。抗生素和β-1,3-葡聚糖酶的协同抗菌活性可能在内生菌螺旋毛壳的植病生防中起重要作用。     

低温和几丁质酶处理对棉铃虫围食膜的影响

应用扫描电镜观察了经低温处理（5℃,24h）和几丁质酶处理的棉铃虫围食膜的形态变化。结果表明,正常围食膜致密平滑,没有孔或缝。低温处理的围食膜产生了孔和缝,孔径可达150nm,使核多角体病毒能进入中肠细胞。经几丁质酶处理的围食膜也出现孔和缝。处理时间越长,破坏越大。几丁质酶处理围食膜对蛋质含量有一定影响,对粮含量变化的影响则较大。     

亚洲玉米螟幼虫膜结合海藻糖酶基因RNAi效应

海藻糖是昆虫的血糖,为昆虫提供能量;海藻糖酶催化海藻糖分解为葡萄糖,是几丁质生物合成的原料。围食膜（peritrophic membranes,PMs）是昆虫消化道特有结构,对昆虫消化食物、保护肠道表皮细胞具有重要作用;几丁质是PMs的重要组分。海藻糖酶（trehalase,Tre）和几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）是几丁质合成途径的第1个和最后1个酶。本研究通过饲喂亚洲玉米螟（Orstrinia furnacalis,Asian corn borer,ACB）膜结合海藻糖酶（OfMT）基因特异的干扰dsRNA,研究RNAi对ACB幼虫中肠CHSB（OfCHSB）基因表达及幼虫发育的影响。发现处理48 h后,OfMT基因和OfCHSB基因表达量分别下降了52%和53%,幼虫发育迟缓。通过对处理及对照ACB幼虫中肠石蜡切片进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-ethanol,HE染色）和几丁质标记,发现血腔内脂肪体组织减小、中肠围食膜组织中几丁质含量减少。推测OfMT基因有可能成为ACB的生物防治的靶标基因。     

昆虫Ⅱ家族几丁质酶的生理功能、结构特征及其抑制剂研究进展

昆虫几丁质酶可以降解昆虫体壁和围食膜中的几丁质,在昆虫蜕皮等生命活动中发挥重要功能。作为参与昆虫几丁质降解系统的关键酶,Ⅱ家族几丁质酶(ChtⅡ)是少见的多结构域、性质复杂的几丁质酶。对昆虫中编码ChtⅡ的基因沉默会导致昆虫蜕皮失败及死亡率增加。对ChtⅡ的生化性质及晶体结构分析表明,其在几丁质降解系统中起到了“先锋及攻坚”的作用。因此,ChtⅡ有望成为新的杀虫剂靶标。本文综述了近年来关于ChtⅡ的生理功能、结构特征及其抑制剂的研究成果,可为基于昆虫几丁质酶的新杀虫剂创制提供参考。     

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

温度对胡瓜新小绥螨生殖力及钠钾泵α亚基基因表达的影响

胡瓜新小绥螨Neoseiulus cucumeris（Oudemans）广泛地用于蓟马类害虫的防治、控制及管理。本研究克隆了1条胡瓜新小绥螨钠钾泵α亚基基因序列,分析了温度对雌螨生殖力及钠钾泵α亚基基因表达的影响。在15、20、25和30℃下,胡瓜新小绥螨在25℃时生殖力最优。在上述温度条件下胁迫48 h,雌螨钠钾泵α亚基在15和30℃下表达量显著上升,能量代谢活跃。表达量越多,表明能量消耗越大,投入生殖的能量就越少,结合生殖力研究结果,二者一致。高温或低温均会降低胡瓜新小绥螨的生殖力,且高温影响更为严重。     

甜菜夜蛾SeCDA8的基因克隆、蛋白表达及几丁质结合活性分析

几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8(GenBank登录号为OL689577),其开放阅读框为1158 bp,编码385个氨基酸。NCBI Blast和系统进化分析表明其属于肠道特异CDA蛋白,与斜纹夜蛾CDA相似度最高。成功构建原核重组表达载体pET30a-SeCDA8,转化大肠杆菌,经超声破碎后在沉淀中表达45 kD的重组蛋白。重组Se CDA8蛋白的几丁质结合活性分析结果显示,Se CDA8蛋白与再生几丁质的结合活性较高于胶体几丁质,但均较弱。q RT-PCR分析显示,Se CDA8在前肠和中肠前部高表达,推测其可能与围食膜形成有关。通过探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶Se CDA8蛋白的几丁质结合活性和组织定位,为更加深入地探究第Ⅴ类CDA的生理功能提供了重要的理论依据。     

暗黑链霉菌PY-1抑菌活性产物的结构鉴定及其对葡萄霜霉病菌的抑制作用

 从暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)PY-1菌株发酵液中分离鉴定抑菌活性产物,评价其对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制作用,为该菌株及其产生的抑菌活性物质的应用提供依据。PY-1菌株发酵液经二氯甲烷萃取,减压浓缩获得抑菌粗提物,稳定性测定结果显示,避光条件下,15℃~65℃、pH 6~10、4℃或常温保存6个月,抑菌活性稳定。采用硅胶柱层析、Sephadex LH-2柱层析、薄层层析和HPLC等技术,对抑菌粗提物进一步分离纯化,得到2种抑菌活性组分;采用ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR等波谱分析技术,对活性组分进行结构鉴定,2种活性组分分别鉴定为5-乙酸环已基酰亚胺(5-acetoxycycloheximide)和环己酰亚胺(cycloheximide)。采用离体叶片法测定2种组分的抑菌活性,不同浓度(10⁴ ng·mL^-1、10² ng·mL^-1、1 ng·mL^-1)的5-乙酸环已基酰亚胺和环己酰亚胺对葡萄霜霉病菌的抑制作用分别为92.59%、86.30%、64.81%和97.04%、91.85%、84.07%。     

几丁质和杀菌剂对生物防治菌生长及其防治棉花病害效果的影响

 研究了化学杀菌剂对木霉菌生长的影响,探讨了几丁质添加物对绿色木霉菌菌株L R、LTR-2、哈茨木霉菌菌株Q1、Q2和粉红粘帚霉菌菌株GLR防治棉花病害效果的影响。多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵在1.66μg/ml时可以完全抑制Q1和Q2的生长,但在2.68μg/ml时才能完全抑制LR和LTR-2的生长。几丁质添加物使L TR-2和Q1防治棉花立枯病的效果完全丧失,但是能使LR从没有防治效果提高到防治效果为34.6%,而对粉红粘帚霉菌的防治效果没有显著影响;对于防治棉花黄萎病来说,几丁质添加物使木霉菌LR、LTR-2和GLR的防治效果降低,但是提高了Q1的防治效果;对于防治棉花枯萎病来说,几丁质添加物能提高所有测定菌株的防治效果。说明不同的生物防治菌株、添加物和病害组合对于获得良好的防治效果是重要的。     

枯草芽孢杆菌B9601-Y2抑菌蛋白活性及产生条件的研究

 枯草芽孢杆菌B9601-Y₂抑菌蛋白可以使棉花红腐病原菌菌丝畸形,呈念珠状,胞壁穿孔,不规则消解,内含物外泄,失活.B9601-Y₂菌株产抑菌蛋白的最适培养条件为:pH 7.0,37℃培养48 h.菌株的马铃薯蔗糖培养液经(NH₄)₂SO₄至80%饱和度盐析能得到0.1 mg/mL以上的粗蛋白,粗蛋白的产量与培养过程中供氧条件、产菌量呈正相关.粗蛋白能耐80℃高温和pH 9.0的碱性,在4℃下,抑菌活性60 d内基本不变.