牦牛源肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

试验结合革兰氏染色及16S rRNA分子鉴定,对分离自红原县的17份牦牛粪便样中的肠球菌进行鉴定。结果显示,通过细菌分离纯化及PCR扩增,从牦牛粪便样品中分离出8株疑似肠球菌,分离菌的扩增产物经凝胶电泳后均产生1 500 bp特异性条带。16S rRNA测序结果显示,8株疑似肠球菌中,6株为粪肠球菌,2株为屎肠球菌。同源性比对分析显示,粪肠球菌与参考序列同源性为99.7%~100.0%,屎肠球菌与参考序列同源性为98.2%~99.2%,说明牦牛源肠球菌在遗传进化过程中高度保守。运用K-B纸片法进行药敏试验,结果显示,分离株对氨基糖苷类抗生素耐受性较高,2株屎肠球菌中,11-1-2菌株表现为5重耐药,且该菌株耐万古霉素,粪肠球菌主要表现为3重耐药,药敏结果提示牦牛源肠球菌耐药较严重,应引起高度重视。     

狐源屎肠球菌的分离鉴定及药敏试验

为研究病死狐的发病原因,从死亡狐狸肺脏中分离出1株细菌,命名为分离株11001。然后对分离菌株进行形态学鉴定、16S rRNA鉴定、特异PCR检测、药敏试验、毒力基因检测以及致病性试验。结果表明,分离株培养可见灰色干燥小菌落,革兰氏阳性球状菌,16S rRNA鉴定为屎肠球菌,PCR扩增条带为112 bp,与屎肠球菌片段大小一致;毒力基因检测显示该分离株携带屎肠球菌的致病基因,对氯霉素及万古霉素表现出一定的敏感性。致病性试验显示,接种分离株小鼠死亡。证实该株狐源分离株为屎肠球菌,且具有致病性,可能是引起狐狸死亡的主要原因。     

利用RFLP分型方法鉴定牛源性链球菌和肠球菌

为分离及种属鉴定引起牛乳腺炎相关的链球菌和肠球菌,本研究于兰州及周边地区采集疑似奶牛乳腺炎乳样382份,通过THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基初步分离到67株疑似链球菌或疑似肠球菌。参照已发表文献合成链球菌属16S r RNA和16S~23S r RNA间隔区基因引物序列,扩增分离菌株16S~23S r RNA间隔区序列,产物分别利用AluⅠ和RsaⅠ单酶切消化,并以参考菌株的16S~23S r RNA酶切图谱为参考,对分离株进行限制性片段多态性(RFLP)分类分析;再选取各RFLP类群的任一菌株,扩增其16S r RNA基因并测序,并经NCBI核酸数据库进行比对,结果显示67株疑似链球菌中有53株为粪肠球菌(79.1%)、3株为屎肠球菌(4.5%)、3株为肠道肠球菌(4.5%)、8株为无乳链球菌(11.9%)。结果表明肠球菌属细菌(粪肠球菌、肠道肠球菌、屎肠球菌)与兰州市及周边地区奶牛乳腺炎的发病紧密相关,肠球菌属细菌与链球菌属细菌16S r RNA基因同源性很高,但可以通过分子生物学方法准确区分。     

牦牛漫游球菌的分离与生物学特性鉴定

为探究1只牦牛屠宰后肝脏有干酪样结节形成的原因,对肝脏进行细菌的分离培养,对分离到的1株细菌的16S rRNA和16S～23S rRNA基因序列用通用引物扩增和并用NCBI blast和MEGA 7进行序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验,结果显示:该菌的16S rRNA为1 524 bp,NCBI GenBank登录号为MG753544.1,与水獭漫游球菌的同源性较高,16S～23S rRNA有大小不同的2个片段,分别为522,425 bp,NCBI GenBank登录号分别为MG758122.1和MG758123.1。Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为迟缓葡萄球菌。该菌对妥布霉素、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感,对苯唑西林、头孢西丁有抗性。结果表明,分离出的细菌为漫游球菌,该菌是否具有致病性还有待进一步试验验证。     

一株鸡源性肠球菌的鉴定及耐药机制分析

本试验旨在鉴定一株从肉鸡体内分离的广谱耐药菌,并从分子生物学角度对该株细菌的耐药机理进行探讨。根据《常见细菌系统鉴定手册》标准对该菌进行培养特性、生化试验鉴定,设计1对16S rDNA通用引物扩增其16S rDNA并测序鉴定;根据该菌的药物敏感性试验结果设计了12对引物扩增其基因组上耐药基因。细菌培养特性和生化试验结果显示该菌为一株肠球菌,PCR扩增出大小为1465 bp的目的片段,药敏试验显示该株细菌耐受多种抗生素,PCR扩增其耐药基因发现存在ant(6)-iv、OXA-10、tetM、CTX-M-1、TEM基因。最终鉴定该株细菌为一株肠球菌,耐药基因的存在是其产生耐药性的原因之一。     

绵羊金黄色葡萄球菌与粪链球菌混合感染研究

为了找出新疆某羊场羔羊陆续发病死亡的原因,试验解剖送检的6只羔羊,对组织病料进行细菌分离培养、染色鉴定、16S rRNA PCR鉴定、测序比对分析,并用分离株进行动物致病性试验和药敏试验。结果表明:病原菌在BHI琼脂培养基上生长情况良好,为灰色不透明小菌落和透明扁平菌落,革兰氏染色为阳性球菌。PCR扩增出的条带大小为1 470 bp,将病原菌16S rRNA序列提交至GenBank中,与金黄色葡萄球菌和粪链球菌核苷酸序列的同源性分别为99%和98%。分离得到的金黄色葡萄球菌对小鼠致病性强,10 h内小鼠均死亡,小鼠对粪链球菌不敏感。分离得到的这2株菌对克林霉素都有耐药性;对硫酸庆大霉素、左氧氟沙星、替米考星和乳酸环丙沙星均有敏感性。说明此次羔羊发病是金黄色葡萄球菌与粪链球菌混合感染引起,交替使用4种敏感药物对该地区养殖场发病羊进行治疗与预防可取得一定效果。     

绵羊羔羊金黄色葡萄球菌与粪肠球菌混合感染的研究

为查明新疆南疆某羊场羔羊陆续死亡的原因,采集该羊场8只羔羊的肺脏、脾脏、肝脏、肾、心等组织,对组织进行细菌的分离培养、染色镜检、16S rRNA基因序列分析、药敏试验判断分离菌株对12种抗菌药物的耐药性。结果表明:通过病原分离、革兰染色镜检发现2种菌,一种为蓝紫色圆形葡萄状的球菌,另一种为椭圆形或圆形链状排列的球菌。分离株在普通培养基上生长不良;BHI培养基上生长良好,形成灰白色不透明、扁平的圆形菌落;在鲜血培养基上形成圆形,周围有完全透明的草绿色溶血环,革兰染色为阳性。病原菌均具有一定的毒力,能够致小白鼠死亡。经16S rRNA序列鉴定,扩增条带大小与预期结果相符,与金黄色葡萄球菌和粪肠球菌序列的同源性分别为99.9%、99.7%。分离出的这2株菌均对氯霉素、氨苄西林、庆大霉素有耐药性,对卡那霉素、红霉素、诺氟沙星、四环素敏感,临床上可交替使用以上药物,达到有效治疗的目的。     

雏鸡屎肠球菌感染的病原学与分子生物学诊断

为了调查雏鸡屎肠球菌感染,从疑似病雏肝脏分离病菌,进行菌落和菌体形态学观察,16SrDNA序列比对,特异PCR分析和病理学观察。结果显示,分离株菌落较小圆形,菌体为圆形或椭圆形,革兰染色阳性。分离株与GenBank中屎肠球菌同源性为99.6%~98.7%,与其他菌株的同源性均小于97%。PCR扩增条带为特异屎肠球菌的目的片段。经分子生物学方法结合菌落及菌体的形态学,该菌被鉴定为屎肠球菌。病理学观察发现,肝脏肿大、出血,肝细胞质疏松并且致病力试验复制出与临床相似病例,这些提示该病雏为屎肠球菌感染。     

屎肠球菌新序列型ST989菌株的分离鉴定及多重耐药性分析

试验从青海民和县某羊场致病性感染半月龄羔羊中分离出革兰氏阳性菌,感染羔羊临床症状有精神萎靡,采食减少,发病1~2 h后死亡。两只濒死羔羊剖检结果发现,其中一只出现肝脏肿大及肝包膜脱落,其余脏器无明显病理变化;另一只各脏器均未发现病理变化。分离病料,革兰氏染色发现,从病料中分离到的细菌均为革兰氏阳性球菌。对分离菌株进行Tuf基因PCR扩增,BLASTn比对结果显示与屎肠球菌AUS0085核苷酸序列相似性为99.8%,据此初步确定这些菌株为屎肠球菌。药敏试验结果表明,这些菌株可分为两类,第1类对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类、利福霉素类抗生素及林可霉素和克林霉素耐药,对氯霉素和万古霉素敏感;第2类对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、利福霉素类抗生素耐药,对红霉素和罗红霉素中度耐药,但对克拉霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、氯霉素和万古霉素敏感。对第1类耐药性代表菌株lby1和第2类耐药性代表菌株lbg3进行多位点序列分析(MLST),结果发现这些菌株为一个屎肠球菌的新序列型,为ST989。系统进化树结果显示屎肠球菌lbg3与屎肠球菌ST468亲缘关系最近,致病力试验结果表明屎肠球菌lby1和lbg3均具有致病性。     

一株猪源气球菌的分离鉴定及致病性研究

为了对一株从猪场分离到的疑似链球菌进行鉴定及致病性研究,试验对从2例80日龄死前四肢呈划水状、口鼻有泡沫流出的猪只中分离出的细菌进行了培养、生化鉴定、药敏试验、16S rRNA的PCR扩增及测序、致病性试验。结果表明:分离到的细菌为绿色气球菌,生化鉴定符合气球菌特性,该菌对头孢噻呋、庆大霉素敏感,获得的序列与NCBI中绿色气球菌序列相似度为100%,该菌对靶动物的致病力较弱,对其生长发育未造成明显的影响。     

一株羊源致病性大肠杆菌分离鉴定

为了研究齐齐哈尔市周边某羊场羔羊发生腹泻的原因,通过对1例腹泻羔羊的粪便进行细菌分离鉴定、生化试验、K-B试纸法进行药物敏感性试验、菌体16S rDNA序列鉴定、动物致病性试验、耐药基因检测。结果从羔羊粪便中分离出一株细菌,菌落形态和生化试验结果与大肠杆菌相符,药物敏感性试验显示对头孢噻肟、头孢他定耐药,对四环素、环丙沙星中介,对阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林敏感。扩增的16S rDNA序列片段大小约1 500 bp,与GenBank对比显示和序列号为NC＿054923.1的大肠杆菌同源性高达99.15%,将细菌接种于小白鼠体内24 h全部死亡,并检测到该大肠杆菌携带EBC耐药基因。为齐齐哈尔市羊源致病性大肠杆菌的研究提供了一定的依据。     

一株致病性粪肠球菌的分离与鉴定

从1羽发病雏鸡中分离到1株溶血性革兰氏阳性球菌。初步分离鉴定后经攻毒试验能够造成小白鼠和雏鸡死亡,具有致病性。药敏试验表明,该菌对多种药物均表现耐药性,仅对庆大霉素、青霉素、氧氟沙星敏感。通过BLAST软件分析该菌株的16S rRNA序列,确定该致病性细菌为粪肠球菌。     

赛马肠道屎肠球菌的分离鉴定

为初步了解赛马肠道细菌的种类分布情况,以及与赛马细菌性疾病的关系,本试验采集昆明某马场赛马粪便样品进行了细菌的分离培养及16S rRNA基因序列分析,并对筛选出的1株可疑细菌进行了药敏试验。结果显示:该菌的菌落形态、生化特性与屎肠球菌相符;16S rRNA分析表明该菌株与屎肠球菌同源性为100%,即在赛马肠道菌群中存在有屎肠球菌;药敏试验显示该菌对目前常用抗生素仍保持较高的敏感性。本文通过对赛马肠道菌群结构的研究,为赛马可能出现的病症及细菌性疾病的预防和治疗提供一定的指导。     

致羔羊脑炎粪肠球菌的分离鉴定

为确定某羊场导致羔羊脑炎的病原,对从3只病死羔羊脑、肝、脾、淋巴结等组织中分离到革兰阳性球菌,采用生化试验、PCR检测、16SrRNA序列分析、进化树分析、药物敏感性及小鼠致病性测定进行鉴定。结果表明,分离菌符合粪肠球菌的生物学特性;对小鼠致病性较强;对庆大霉素、红霉素、克林霉素、万古霉素等有较强的耐药性,对呋喃妥因极敏感,对青霉素、氨苄西林、环丙沙星等敏感;应用DNA Man软件对分离株WS1、WS2、WS3、WS4、WS5 16SrRNA基因序列进行同源性比对,结果与GenBank数据库中粪肠球菌(NR-040789.1)的同源性分别为99.2%、99.0%、98.5%、98.5%和98.8%;经MEGA4.0软件分析的分子系统进化树(N-J法)表明5株分离菌与粪肠球菌之间的亲缘性最近。说明该羊场导致羔羊脑炎并死亡的病原为粪肠球菌。     

猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立

粪肠球菌和屎肠球菌是引起猪感染发病的优势肠球菌种,以肠球菌的16 S rRNA基因设计属特异性引物,利用SodA基因多态性设计种特异性引物,同时优化反应条件,建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR方法。通过对来源于猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株进行测定,均能成功扩增出属特异性片段和种特异性片段。经过与快速生化鉴定试剂盒(Vitek-32)和16 S rRNA测序方法比较,多重PCR与16 S rRNA测序方法对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率100%;与Vitek-32鉴定符合率为62.3%,其中,与分离于感染猪的临床菌株符合率仅有46.7%,特别是感染猪的屎肠球菌,符合率仅为22.3%。     

鲜蛋表面屎肠球菌耐药性及万古霉素vanA基因检测

为了研究新鲜鸡蛋表面屎肠球菌耐药性和万古霉素A(vanA)基因的携带情况,试验在养鸡场收集新鲜鸡蛋,分离蛋壳表面的屎肠球菌,用16S rDNA通用引物对分离的屎肠球菌进行种属鉴定,K-B纸片琼脂扩散法进行耐药性分析,并检测耐万古霉素屎肠球菌携带vanA基因的情况。结果表明:革兰氏染色镜检可见革兰氏阳性单个、成对或短链状排列的圆形菌体,符合屎肠球菌的染色和形态特征;从200枚鸡蛋样品中分离到38株屎肠球菌,分离率为19%;分离到的屎肠球菌对14种抗生素表现出不同程度的耐药性,耐药谱广,最多发现8重耐药菌;在5株耐万古霉素的菌株中检测到了vanA基因。说明新鲜鸡蛋蛋壳表面的屎肠球菌对抗生素耐受性较高,对屎肠球菌特别是耐万古霉素屎肠球菌的监测具有公共健康意义,需要进一步调查以评估食源性传播给人类带来的风险。     

牦牛源干燥棒状杆菌的分离与鉴定

一只牦牛屠宰后肝有干酪样结节,为了探究其形成原因,本研究对该牦牛肝进行细菌的分离培养,对所分离可疑致病菌的16SrRNA以及rpoB基因序列进行扩增和序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验。结果显示,经细菌分离培养得到一株革兰阳性、棒状、可疑致病菌;其16S rRNA扩增片段大小1 483bp,GenBank序列编号为MH000696,该菌的16SrRNA与干燥棒状杆菌GD34株(KF928790.1)等的相似性最高,序列一致性为99%,系统进化树显示,本菌与干燥棒状杆菌在同一进化分支上;rpoB基因扩增片段大小434bp,GenBank序列编号为MH006608;Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为变异库克菌,可信度为93%。该菌对妥布霉素、氨曲南、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感。综上所述,分离的细菌为干燥棒状杆菌,但基因序列,如rpoB等以及生化表型均存在一定程度的变异,本研究为兽医临床上该菌的分离和鉴定提供了依据,且为该菌的致病性研究奠定了基础。     

广东省某屠宰场猪源肠球菌的分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

【目的】了解猪源性肠球菌分离株的耐药情况及毒力因子携带情况,为肠球菌的耐药监测提供数据支持并为制定合理的治疗方案提供科学依据。【方法】本研究对广州市某大型屠宰场屠宰环节156份猪小肠样品进行肠球菌的分离培养、革兰染色、PCR鉴定,采用琼脂扩散法对菌株进行14种抗菌药物和2种消毒剂的最小抑菌浓度(MIC)测定,利用PCR技术检测耐药基因、毒力基因和消毒剂抗性基因的携带情况。【结果】本研究分离到84株肠球菌(分离率为53.85%),包括44株粪肠球菌和40株屎肠球菌;分离培养可见菌落边缘光滑整齐、圆形或卵圆形排列、菌落周围培养基呈现黑色的菌落;疑似菌落革兰染色后呈圆形的革兰阳性球菌,单个或成堆排列在一起。对疑似菌落DNA进行PCR扩增,其中粪肠球菌引物扩增出大小约941 bp的条带,16S rRNA引物扩增出大小约1 500 bp的条带。药敏试验结果显示,44株粪肠球菌对克林霉素、多西环素、头孢噻呋、庆大霉素、红霉素、苯扎氯铵和氟苯尼考的耐药率较高,分别为97.7%、90.9%、88.6%、88.6%、81.8%、81.8%和77.3%;40株屎肠球菌对克林霉素、头孢噻呋、多西环素、庆大霉...     

一株羊源致病性屎肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

试验从甘肃肃南县某羊场死亡羊中分离出疑似某球菌菌株XCP,为进一步确定该致病菌株及其耐药性情况,进行了病原菌分离、革兰氏染色、生化试验、16S rRNA PCR扩增鉴定、小鼠致病力试验、药敏试验、毒力基因和耐药基因扩增试验研究。结果发现,该菌革兰氏染色阳性,高盐、蜜二糖、蔗糖等生化反应阳性,VP、马尿酸盐、阿拉伯糖等生化反应阴性;16S rRNA基因PCR扩增后,进行BLAST比对,结果与GenBank中的屎肠球菌16S rRNA基因序列同源性为100%;小鼠致病力试验发现,该菌株具有很强的致病性;该菌株对β-内酰胺类抗生素苯唑西林、青霉素G,喹诺酮类抗生素诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星,以及四环素等高度耐药,对红霉素、万古霉素、克林霉素等抗生素敏感;毒力基因Asal、cylA、acm和耐药基因TetM、ant（6）-Ⅰ、aac（6'）-aph（2"）、ermB扩增均为阳性。结果表明,该菌为屎肠球菌（Enterococcus faecium）,具有较强的致病性和耐药性,可能与毒力基因和耐药基因的高阳性率有关。     

一株斯里兰卡星龟体内香味类香味菌高度同源株的分离与鉴定

旨在对海南某陆龟保育基地内患病斯里兰卡星龟体内的病原菌进行分离鉴定。收集了2只死亡斯里兰卡星龟的病料,通过病理解剖、触片镜检、细菌分离培养、16S r RNA基因扩增测序等方法鉴定细菌,基于16S r RNA序列构建系统发育树,鉴定分离菌生理生化特征,进行药敏试验筛选敏感药物。结果:从2只病死星龟病料内分离得到6株相互间高度同源的革兰阴性杆菌,为同一种属细菌,命名为HN20161121SUN,16S r RNA鉴定显示出该菌与香味类香味菌(Myroides odoratimimus)CCUG 39352同源性达99.41%,且在系统进化树上聚为一枝,生理生化特征鉴定进一步验证该菌符合香味类香味菌细菌生理生化特征,药敏试验显示该分离菌仅对测试的16种抗生素中的磺胺异噁唑敏感。