H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种H3N2亚型犬流感病-毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用CIV重组HA1蛋白作为检测抗原,建立H3N2亚型CIV抗体的间接ELISA检测方法,并优化反应条件.通过检测阴性血清样本30份确定其临界值为0.228.该方法与抗猪流感病毒H1N1、H1N2、H6N6、H9N2的阳性血清和犬瘟热病、犬细小病、犬副流感的阳性血清均无交叉反应.变异系数在1.01％～7.52％之间,具有较好的重复性.通过对150份临床样品进行检测并与血凝抑制试验检测结果比较,总符合率为98.6％.本研究为CIV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法.     

H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。     

H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法成功扩增了H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)四川分离株(A/Swine/Sichuan/01/2006)的NS1基因,将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET32-NS1.将该质粒转化进大肠杆菌RosettaTM,经终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE电泳表明融合的NS1蛋白得到了大量的表达,该融合蛋白的相对分子质量约为43 500.Western-blotting结果显示该蛋白能与阳性血清发生特异性反应具有很好的免疫反应原性.结果表明,所建立的ELISA方法与几种常见猪群传染病病原无交叉反应,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可进一步优化应用于临床SIV的检测.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组伪狂犬病病毒的构建

将SV40启动子控制下的LacZ基因表达盒和CMV启动子控制下的H3N2亚型猪流感病毒（SIV H3N2）的HA基因插入到伪狂犬病病毒（PRV）通用转移载体pBdTK-Uni中，获得转移载体pLTK-HA。将该载体与PRV Bartha-K61株基因组DNA通过脂质体法共转染Vero细胞，经过10代蓝斑筛选、纯化和PCR鉴定获得了一株插入SIV HA基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-HA。Western blotting和间接免疫荧光试验证实HA基因在重组病毒感染的细胞中获得了表达。用不同的细胞（PK-15、IBRS-2、Vero和鸡胚成纤维细胞）对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和致细胞病变进行比较，未见显著差异，对第30代重组病毒的HA基因进行序列分析，表明该重组病毒遗传性状稳定。     

H3N2亚型猪流感病毒多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

本试验将初步纯化的H3N2猪流感病毒注入到新西兰大白兔体内,获得了抗猪流感病毒多克隆抗体,以纯化后的猪流感病毒为抗原,初步建立了间接ELISA检测方法,确定了抗原最佳包被浓度为41.25μg／ml,血清的最佳稀释度为1：400,酶标抗体的最佳稀释度为1：1000,一抗的最佳作用时间为30min。     

利用H9亚型的HA1蛋白建立ELISA抗体检测方法

该试验对ELISA反应条件进行摸索,并确定了最适工作条件。结果表明,重组蛋白最适包被浓度为200倍稀释,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度为1∶50,HRP-兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1：1000,待检血清和酶标二抗的反应时间均37℃30min,底物在室温显色10min。根据已经建立的ELISA方法及反应条件,确定阴阳性临界值为0.109。     

猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

猪流感病毒A／Swine／Fujian／668／2001（H3N2）株感染的鸡胚尿囊液，经差速离心后，再经蔗糖密度梯度离心，提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融，作为猪流感间接ELISA抗原，确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测，经统计学分析，确定间接ELISA判定标准，被检血清OD490nm值≥0．20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应，批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3．34％～8．12％和6．2％～9．04％之间。与HI的符合率达到92．8％，经卡方检验（P〈0．01）比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。     

H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010（H3N2）的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a（+）原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21（DE3）pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2 ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。     

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

采用RT-PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接,进行序列测定。测序结果显示,4个毒株均含有完整的开放阅读框,并且均未发现核苷酸插入或缺失现象;分离毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.7%,氨基酸同源性为98.2%~99.3%。同源性分析表明,4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性(均在99%以上),说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大,重组的频率不是很高,同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性(均为99.4%)。交叉血凝抑制试验显示,S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位,应密切监测猪流感。     

犬瘟热病毒重组H蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测水貂犬瘟热病毒(CDV)血清抗体的间接ELISA方法,将CDV的血凝素蛋白(H)基因的主要抗原表位片段克隆至p ET-30a-c(+)载体中,转化至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。以纯化的重组H蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法,并证实该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。采用建立的方法与国外商品化的犬瘟热抗体检测试剂盒对80份血清进行检测,两者符合率为92.5%。本研究建立的间接ELISA方法为水貂抗体水平检测和评价犬瘟热疫苗免疫效力提供了简便快速的方法。     

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。     

Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 10⁶ dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method.     

H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达

为表达H9N2亚型禽流感病毒的HA1蛋白,从H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株中扩增其HA1基因片段,将扩增得到的HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化到BL21 (DE3)中进行表达.结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件确定最佳诱导时间为8h,IPTG最佳终浓度为0.8 mmol/L.经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达产物的分子质量约为61 ku.     

Prokaryotic Expression and Antigenic Analysis of H3N2 Swine Influenza Virus HA1 and HA2 Genes

Hemagglutinin protein plays an important role in disease prevention and treatment of the swine influenza virus (SIV).In order to clone and express subtype H3N2 SIV A/swine/Henan/1/2010 (H3N2) HA1 and HA2 genes with chicken embryo allantoic fluid containing the H3N2 SIV after extraction of RNA.The HA1 gene and HA2 gene were amplified from the total RNA using RT-PCR and they were inserted into prokaryotic expression vector pET-28a (+) to construct recombinant expression vector.Then the vector was transformed and expressed in E.coli BL21 (DE3) pLyS.Then the bacteria were induced by IPTG and their lysates were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting,respectively.The monoclonal antibody 1C10,which was specific to HA protein,was used as primary antibody in Western blotting analysis.It was found that the expressed recombinant HA1 protein was 34.8 ku and recombinant HA2 protein was 23.2 ku analyzed by SDS-PAGE.As demonstrated by Western blotting,this HA1 expressed products showed the capacity of reacting with monoclonal antibody 1C10.All the results suggested that the expressed HA1 and HA2 proteins of H3N2 influenza virus would be very helpful in the development of rapid diagnosis method and vaccine development,which would facilitate further study on the function of HA at the same time.     

猪流感病毒山东分离株H1N1亚型HA基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术对分离的H1N1亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,进行序列测定.同源性分析结果表明.分离毒株与其他H1N1亚型猪流感病毒的HA基因核苷酸同源性为70.7%～90.8%,与A/swine/Zhejiang/1/2007的同源性最高,与其他毒株的同源性相对较低.系统进化树分析结果表明.山东分离株的HA基因与欧洲谱系猪流感病毒进化关系最近,证明该分离株可能来源于北美谱系和欧亚谱系猪流感病毒的重组.     

猪流感病毒山东分离株H1N1亚型HA基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术对分离的H1N1亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,进行序列测定。同源性分析结果表明,分离毒株与其他H1N1亚型猪流感病毒的HA基因核苷酸同源性为70.7%～90.8%,与A/swine/Zhejiang/1/2007的同源性最高,与其他毒株的同源性相对较低。系统进化树分析结果表明,山东分离株的HA基因与欧洲谱系猪流感病毒进化关系最近,证明该分离株可能来源于北美谱系和欧亚谱系猪流感病毒的重组。     

1株猪源H9N2亚型流感病毒的分子特征

旨在进一步了解山东省猪流感的流行情况及其病原特征,笔者于2019年春季,在山东省泰安某屠宰场采集130份猪鼻拭子,进行病毒分离鉴定;并对分离病毒进行全基因组测序和分子特征分析;用禽H9N2亚型标准抗原联合血凝抑制方法检测2018—2019年从山东省8个地区猪场采集的1 527份猪血清样品中的猪流感病毒抗体。结果显示：分离到1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/swine/Shandong/TA009/2019（H9N2）。分离病毒与A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL20/2018（H9N2）和A/environment-air/Kunshan/NIOSH-BL25/2018（H9N2）遗传关系最近,其基因片段的核苷酸相似性均在99.5%以上。分离病毒的HA和NA基因属于Y280-like分支,PB2和M基因属于G1-like分支,PB1、PA、NP和NS基因属于SH/F98-like分支。分离病毒HA蛋白裂解位点处的氨基酸序列为“PSRSSR/GL”,符合低致病性禽流感病毒的分子生物学特性。HA蛋白的216位为L,具有结合人源唾液酸α 2,6-Gal的能力。血清学分析结果显示,9份血清中H9N2抗体呈阳性,其总阳性率为0.59%。综上：本研究分离到1株猪源H9N2亚型流感病毒,并在猪血清中检测到H9N2抗体,提示应加强对猪流感的流行情况及其病原特征的持续监测。