结核分枝杆菌Rv3519表达与其生物被膜形成能力的研究

采用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜的形成能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测生物被膜态的不同结核分枝杆菌Rv3519表达水平,分析Rv3519基因表达与结核分枝杆菌生物被膜形成能力的关系。结果表明:临床分离株产膜能力较H37Rv明显偏低,差异显著(P0.01);临床分离株之间生物被膜产量差异不显著(P0.05);生物被膜态的分离株较标准株Rv3519基因表达量偏低,差异显著(P0.01)。说明结核分枝杆菌生物被膜形成能力与Rv3519基因表达水平相关,Rv3519基因可以作为结核分枝杆菌生物被膜形成能力的潜在分子诊断标志。     

组氨酸激酶基因envZ调控禽致病性大肠埃希菌生物被膜的机制研究

目的 研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物被膜形成能力的影响,了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制,为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。方法 采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株,比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。结果 成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ;envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响,但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比,envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达,与生物被膜形成相关的基因显著下调。结论 envZ基因除了响应环境渗透压,还参与调控APEC生物被膜的形成。     

禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力及相关特性分析

[目的]本研究旨在分析能形成生物被膜的临床分离禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株的生物学特征.[方法]用刚果红平板法对70株APEC进行筛选,并用结晶紫染色法鉴定菌株生物被膜的形成能力;通过测定不同时间生物被膜生长情况,推断菌株的膜成熟时间;依据玻璃试管法判断菌株是否有卷曲菌毛以及形成生物被膜基质中是否含有胞外纤维素,同...     

14株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析

为了解鸭疫里默氏杆菌的流行情况,对信阳地区疑似鸭疫里默氏杆菌感染病料进行病原分离和鉴定。结果显示,共鉴定到14株鸭疫里默氏杆菌,其中血清1型、2型和10型菌株依次为3、4、2株,未定血清型菌株5株;动物致病性试验结果显示,分离菌对雏鸭均具有致病性。对11种抗菌药物敏感性检测结果表明,分离菌株对阿米卡星、链霉素和头孢曲松较为敏感,对氟苯尼考、阿莫西林、磺胺异■唑、多黏菌素B和多西环素耐药性较高;生物被膜检测结果表明,14株菌株中有8株为强生物被膜形成株,2株为弱生物被膜形成株。     

嗜水气单胞菌双组分系统FlrBC的功能探究

为明确双组分系统FlrBC在嗜水气单胞菌极生鞭毛合成、生物被膜形成及致病机制中的作用,通过同源重组法,以嗜水气单胞菌ZYAH72为野生菌株构建双组分系统FlrBC缺失株ΔflrB和ΔflrC,比较不同菌株鞭毛合成及游动性、生物被膜形成、胞外多糖分泌、细胞黏附以及抗全血杀伤能力差异。结果显示:与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC仍能形成极生鞭毛,细菌游动能力无显著差异;而结晶紫染色发现ΔflrB和ΔflrC相较于野生株的生物被膜形成能力分别下降了27.2%和22.3%;刚果红检测结果显示,与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC的胞外多糖分泌分别下降了18.4%和14.2%;实时荧光定量PCR的结果显示,flrB和flrC的缺失不同程度抑制了鞭毛合成、生物被膜相关通路基因的表达;与草鱼肾细胞共孵育后,ΔflrB和ΔflrC的细胞黏附率与野生株相比分别下降了23.2%和18.2%;全血杀伤实验结果显示,ΔflrB和ΔflrC抗全血杀伤能力均显著减弱。以上结果表明,双组分系统FlrBC不是嗜水气单胞菌极生鞭毛形成所必需,但在细菌鞭毛形成组装和生物被膜形成中发挥调控作用,并且影响嗜水气单胞菌致病性...     

副溶血弧菌ompA基因缺失株的生物学特性及致病性分析

[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。     

pagP基因缺失对禽致病性大肠埃希菌外膜特性的影响

【目的】研究pagP基因缺失对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜特性的影响。【方法】采用最低抑菌浓度(MIC)试验探索pagP基因缺失对菌株生物被膜通透性的影响;通过菌体自聚合试验、外膜疏水性试验以及生物被膜形成条件,分析pagP基因缺失对生物被膜形成能力的影响,并在扫描电镜下观察细菌生物被膜形态。【结果】pagP基因缺失后,菌株MIC降低,菌株的外膜通透性增强且菌体自聚合能力显著增强(P0.01),其中红霉素和氨苄西林的MIC分别为7和20μg/mL,菌株自聚合能力为87.89%;pagP基因缺失对菌株外膜疏水性无显著影响,疏水性仅为5.337%;随着细菌在LB培养基中静置培养时间的延长,生物被膜形成量增多;pagP基因缺失株的生物被膜形成能力高于野生株。【结论】pagP基因缺失可使APEC外膜特性发生改变,生物被膜形成能力增强。     

禽致病性大肠杆菌ETT2转录因子eivF缺失株的生物学特性及转录组学分析

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(APEC)Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录因子eivF缺失株,并对其进行生物学特性及转录组学分析,探究转录因子eivF基因在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建APEC ETT2转录因子eivF基因缺失的APEC AE81△eivF株及其回复株AE81 C-eivF,通过运动性、生物被膜形成等试验分析eivF对APEC生物学功能的影响;并利用转录组学方法分析eivF在转录调控网络中对细菌鞭毛和生物被膜等相关因子的转录调控作用。【结果】成功构建了APEC eivF基因缺失株AE81△eivF和回复株AE81 C-eivF;生物学结果表明,与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF运动能力降低,生物被膜形成褶皱堆砌且厚度增大,空间结构呈立体、多层次状,并形成类似于三维塔状结构的突起,回复株AE81 C-eivF运动能力和生物被膜形成能力基本恢复;与野生株AE81相比,缺失株AE81△eivF有576个基因差异表达,且鞭毛和生物被膜等相关基因在转录水平上均发生显著变化。【结论】ETT2的转录因子eivF参与调控APEC的生物表型变化,其可能通过调控鞭毛、生物被膜相关基因而调控APEC致病过程。     

大肠杆菌O157:H7生物被膜状态下基因表达分析

生物被膜是细菌适应不良环境形成的一种特殊胞外结构，当细菌从浮游状态转换成生物被膜状态后其生理代谢活动也会随之发生改变。为了研究细菌形成生物被膜后生理代谢途径的变化及生物被膜形成的分子调控机制，以食源致病性大肠杆菌O157:H7为试验对象，对其在浮游状态和生物被膜形成状态下的转录组进行测序分析。结果表明，与浮游状态相比，大肠杆菌O157:H7在生物被膜形成状态有1 652个显著差异表达的基因（上调821个，下调831个），其中鞭毛组装、细菌趋化性和双组分系统调控蛋白基因等在生物被膜形成阶段表达上调；ABC转运系统调控蛋白基因等表达下调。同时，碳代谢、氮代谢、脂肪酸代谢等多个代谢途径也发生了变化。上述结果为深入研究生物被膜形成的分子机制提供数据支持。     

奶牛源金黄色葡萄球菌新疆流行株生物被膜形成及相关基因的分布与转录水平

[目的]了解金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)临床分离株的生物被膜形成情况及黏附素和ica操纵子与生物被膜形成能力的相关性,为系统掌握新疆地区奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科学依据.[方法]收集临床分离鉴定的164株SA新疆流行株,采用结晶紫半定量黏附试验(MPA)测定各流行株的体外生物被膜形成能力,同时通过PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对SA生物被膜形成相关基因转录水平进行检测分析.[结果]164株奶牛源SA新疆流行株的生物被膜阳性率为86.0%(141株),其中弱(+)生物被膜形成有69株(占42.1%)、中等(++)生物被膜形成有38株(占23.2%)、强(+++)生物被膜形成有34株(20.7%).在141株MPA阳性SA分离株中,clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因检出率分别为83.7%(n=118)、58.9%(n=83)、75.2%(n=106)、78.7%(n=111)、75.9%(n=107)、58.9%(n=83)、90.1%(n=127)、79.4%(n=112)和100.0%(n=141);ica基因(icaA、icaC和icaD)检出率总体上高于其他生物被膜形成相关基因,且生物被膜形成能力强(+++和++)的菌株尤为明显;clfB、fnbA、cna和fib基因检出率则表现为MPA阴性菌株高于MPA阳性菌株.9个生物被膜形成相关基因中有7个基因(clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD)在强(+++)生物被膜形成能力SA分离株中的表达量显著上调(P<0.05).[结论]奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成率高,生物被膜形成相关基因携带率也较高,其中clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD基因的表达与SA生物被膜形成密切相关.     

生防细菌MS82中GGDEF结构域基因对生物被膜形成及运动性的影响

为探究荧光假单胞菌MS82中GGDEF结构域基因对c-di-GMP调控细菌生物被膜形成及运动能力的影响,通过抑菌圈法、小试管法、96微孔板法以及运动性平板分别检测GGDEF缺失突变体MT5092、MT0189、MT19和MS82野生型菌株之间的相关生命活动能力的差异。结果显示,GGDEF缺失突变型菌株MT5092、MT0189、MT19的抑菌活性、生物被膜形成能力、运动能力(游泳运动、集群运动及抽搐运动)皆低于突变前的MS82野生型菌株,且突变株与野生株的抑菌活性存在极显著差异(P<0.01);36 h的生物被膜形成能力存在极显著差异;运动行为存在不一致的显著(P<0.05)或极显著差异。最终得出结论：缺失GGDEF结构域基因会降低胞内c-di-GMP浓度水平,进而影响MS82菌株的生物膜及运动行为。     

奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相关基因分析

 【目的】研究临床分离的奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成能力,相关基因的分布及二者之间的关系;【方法】利用通用硅胶片法培养葡萄球菌生物被膜,经充分洗涤后对生物被膜进行银染定性判断菌株形成生物被膜的能力,通过生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测菌株生物被膜的形成能力,并用扫描电镜观察被膜结构,对葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB进行PCR扩增检测。【结果】 银染法定性结果显示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可见的生物被膜,生物被膜形成率为87.6%;结晶紫染色定量检测与硅胶粘附的有132株,不粘附的有5株。试验所用的137株葡萄球菌中,57株能扩增出bap基因;有43株和54株分别能扩增出icaAD和icaBC;有73株、49株和38株分别扩增出sigB、sar和agr;分别有76株和50株染色体中存在clfaA和clfaB;fnbpA和fnbpB分别在52株和26株菌株中扩增出。【结论】推测bap、sigB、sar、icaAD和icaBC基因是生物被膜形成的重要相关基因;agr及粘附素基因clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB对生物被膜形成的作用不明显。     

超高压对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

为探究超高压处理对单增李斯特菌被膜形成能力的影响。以2株4b血清型的单增李斯特菌(Wa X12、ATCC13932)为研究对象进行超高压处理(100~500 MPa,15 min,20℃),通过24孔板结晶紫染色方法对2株菌生物被膜形成能力进行检测,结合荧光显微镜和扫描电镜来观察生物被膜形成情况。Wa X12比ATCC13932形成被膜的能力强。100 MPa压力处理显著增强Wa X12的被膜形成能力(P0.05),200 MPa压力处理使ATCC13932被膜形成量显著增多(P0.05),而大于300 MPa的超高压处理使2株菌的被膜形成量均显著减少(P0.05)。荧光显微镜和扫描电镜观察结果与结晶紫染色结果相符,超高压处理对2株单增李斯特菌被膜形成能力均有影响。小于200 MPa压力处理后单增李斯特菌被膜形成能力增强,并在48 h后被膜形成量达到最大值。     

禽源沙门菌生物被膜形成能力与耐药性分析

为探讨禽沙门菌生物被膜形成能力与耐药性的关系,对临床样品进行沙门菌分离,通过多重PCR方法和序列分析测定其血清型,结晶紫染色定量法测定其生物被膜形成能力,最低抑菌浓度(MIC)测定其对药物敏感性。结果表明:共分离到16株禽沙门菌,其中鸡白痢沙门菌7株、鼠伤寒沙门菌6株、肠炎沙门菌2株、纽波特沙门菌1株;药敏试验结果显示16株禽沙门菌对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、氧氟沙星、氯霉素、诺氟沙星有较强的敏感性;87.5%的禽沙门菌能形成生物被膜,相对于浮游状态,沙门菌形成生物被膜后MIC值至少提高16倍,最高超过1 024倍。因此,处于生物被膜状态下的沙门菌可显著提高其对抗生素的抵抗力。     

嗜水气单胞菌Ⅵ型分泌系统假定效应蛋白基因tle1~(AH)的生物学功能

[目的]本文旨在鉴定和研究嗜水气单胞菌中国流行株NJ-35的Ⅵ型分泌系统(T6SS)新型效应蛋白及其功能,进一步阐明其致病机制。[方法]基于已报道的保守结构域DUF4123,对NJ-35株全基因组序列进行潜在的T6SS效应蛋白基因预测,采用同源重组技术构建基因缺失株和相应互补株。对野生株、缺失株和互补株分别进行细菌竞争试验,并测定细菌生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、抗巨噬细胞吞噬能力及其对斑马鱼的半数致死量(LD_(50))等。[结果]成功预测到假定的效应蛋白基因tle1~(AH)(U876-17550),并构建tle1~(AH)基因缺失株(Δtle1~(AH))和相应互补株(CΔtle1~(AH))。特性分析发现,与野生株比较,缺失株抑制大肠杆菌生长和抗小鼠巨噬细胞吞噬的能力明显降低,生物被膜形成能力增强,对斑马鱼的LD_(50)增加10余倍(P0.01),互补株各项指标均恢复到野生株水平。[结论]鉴定到嗜水气单胞菌T6SS的一个假定效应蛋白基因(tle1~(AH)),并对其功能进行初步研究,为进一步探讨T6SS在该菌致病过程中的作用奠定基础。     

溶藻弧菌生物被膜的特性与相关基因的研究

建立溶藻弧菌（gibrioaigino／yticus）的生物被膜（BF）体外形成模型,用银染法观察检测溶藻弧菌HY9901生物被膜的形成;同时研究温度和消毒剂对HY9901的游离（FC）细菌和具有生物被膜（BF）的细菌的影响。实验结果表明,溶藻弧菌HY9901株可以形成BF,而非致病株ZJ017不形成BF。HY9901株的BF细菌经85℃30min、-20℃80d、0．01％新洁尔灭处理后均有存活,而游离（FC）细菌则无存活细菌。根据已发表的哈氏弧菌Lux R基因核酸序列,设计并合成了一对引物,对溶藻弧菌HY9901株的基因组进行PCR扩增和测序分析,扩增出了520bp的核苷酸片段,该片段与已发表的哈氏弧菌Lux L基因的同源性达95％,而非致病性菌株ZJ017株则扩增不出该基因片段。     

嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响因素

采用改良的微孔板法对不同条件下嗜水气单胞菌生物被膜的形成量进行比较分析。结果显示,嗜水气单胞菌生物被膜形成量最高的时间为12 h;25 ℃条件下,在16、24、48 h分别测定生物被膜形成的D₅₇₀值,皆显著高于37 ℃;葡萄糖浓度在0~2%(m/V)时可以促进生物被膜的形成,当浓度大于3%时有抑制作用;当氯化钙浓度达到10.0 mmoL·L^-1时,生物被膜形成的D₅₇₀值显著上升,而氯化镁对生物被膜形成的D₅₇₀值无显著提高。人纤维蛋白原对嗜水气单胞菌生物被膜的形成有极显著的抑制作用,不同浓度的纤维蛋白原各组间无显著差异。     

信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌的调控作用

[目的]研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌(APEC)的调控作用.[方法]采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响.Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响.活菌计数法观察AI-2对APEC黏附和入侵鸡胚成纤维细胞DF-1的影响.[结果]AI-2在浓度为0.185 mmol·L-1时,生物被膜形成能力显著增强,而浓度为0.037mmol· L-1和0.285mmol·L-1时,生物被膜形成能力无显著变化.Real-time PCR结果显示加入AI-2后,APEC毒力基因pfs,vat,luxS,tsh,fuyA,iucD转录水平显著下调,ompA和iss则上调.加入AI-2后,APEC对DF-1细胞的黏附和入侵能力分别下降到原来的57.35％和36.64％.[结论]AI-2对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成具有浓度依赖性,在适宜浓度下能显著增强.AI-2能减弱禽致病性大肠杆菌毒力基因的转录水平和对DF-1的黏附和入侵能力.表明AI-2参与调控APEC致病性.     

生牛乳中高黏液型肺炎克雷伯菌耐药、毒力及生物被膜形成能力分析

【目的】评估分离自生牛乳及其环境中高黏液型肺炎克雷伯菌（hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae,hmKP）的生物被膜形成能力及耐药毒力风险,对其可能引起的潜在风险提出警示,进而为肺炎克雷伯菌（KP）的科学防治提供理论参考。【方法】采用药敏纸片法鉴定32株hmKP产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型,以半定量结晶紫法检测其生物被膜形成能力,并通过PCR对hmKP携带的耐药基因和毒力基因进行检测分析。【结果】从32株hmKP中共鉴定出ESBLs阴性菌株（non-ESBLs-KP）24株（占75.00%）、ESBLs阳性菌株（ESBLs-KP）8株（占25.00%）,均可形成生物被膜,其中,10株具有强生物被膜形成能力,17株具有中等生物被膜形成能力,5株表现为弱生物被膜形成能力。在10株具有强生物被膜形成能力的hm KP中有7株来自生牛乳样本,且ESBLs-KP中具有强生物被膜形成能力的菌株检出率（37.50%）高于non-ESBLs-KP中的检出率（29.17%）。所有hmKP至少携带4种以上的耐药基因,其耐药风险排序依次为四环素类=氨基糖苷类&g...     

动物源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力与分子分型关系研究

[目的]调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征,探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性,为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据.[方法]以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象,用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力,将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定,通过...