对虾白斑综合征病毒wsv477基因的克隆表达与时相分析

将对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的功能基因wsv477克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中,并转化大肠杆菌BL21,37℃条件下诱导了WSV477蛋白的表达,并以纯化的融合蛋白作为抗原,免疫小鼠获得了多克隆抗体.该基因开放阅读框共624个核苷酸,编码208个氨基酸,GST融合蛋白相对分子质量为49000,抗体滴度为1:10000.RT-PCR和Western blot分析表明,该基因在病毒感染4h后开始转录,6h后开始表达,是WSSV感染的早期基因.     

对虾白斑综合症病毒wsv477基因的克隆表达与时相分析

将对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的功能基因wsv477克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中,并转化大肠杆菌BL21,37℃条件下诱导了WSV477蛋白的表达,并以纯化的融合蛋白作为抗原,免疫小鼠获得了多克隆抗体.该基因开放阅读框共624个核苷酸,编码208个氨基酸,GST融合蛋白相对分子质量为49000,抗体滴度为1:10 000.RT-PCR和Western blot分析表明,该基因在病毒感染4h后开始转录,6h后开始表达,是WSSV感染的早期基因.     

橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达

克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。     

甘薯Ran基因的克隆和表达分析

Ran蛋白是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白和RNA分子的运输过程。研究发现有些Ran基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得甘薯Ran基因,本试验通过RT-PCR克隆了1个甘薯Ran基因。测序结果显示其含有长666 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含221个氨基酸,推测分子量为25.15 kDa。比对分析发现甘薯与多种生物的Ran蛋白的氨基酸序列同源性都超过90%,荧光定量PCR研究表明IbRan基因受低温、PEG、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控甘薯的抗逆性奠定了基础。     

商陆抗病毒蛋白基因的克隆、序列分析及在原核中的表达

 从美洲商陆 (Phytolaccaamericana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA ,经RT PCR扩增出缺失突变型PAP基因 ,将该基因与克隆载体pGEM(r) T相连接 ,从SP6和T7两端同时对其进行序列测定 ,共测得 711个碱基 ,与国外报道的PAP基因序列相比较 ,其同源性达 99.6 %。同时将该基因克隆至原核表达载体pET 5a上 ,转化大肠杆菌菌株BL2 1(DE3) plysS ,在 0 .4mmol/LIPTG的诱导下表达 ,经SDS PAGE分析表明 ,该基因在大肠杆菌中得到了特异性表达 ,表达蛋白大小为 2 6ku ,与预期值相符。Westernblotting分析发现该表达蛋白与法国PAP抗血清有特异反应。琼脂双扩散免疫沉淀法鉴定发现表达蛋白与其自己的抗血清及法国的PAP抗血清均能形成免疫沉淀线 ,且这两条沉淀线在相交处呈融合状态 ,说明原核表达的该蛋白与法国从商陆叶片中提取出的PAP具有高度的同源性 ,也说明本试验准确克隆到了PAP基因且在大肠杆菌中得到了表达     

商陆抗病毒蛋白基因的克隆、序列分析及在原核中的表达

从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA,经RT－PCR扩增出缺失突变型PAP基因,将该基因与克隆载体pGEM(r)-T相连接,从SP6和T7两端同时对其进行序列测定,共测得711个碱基,与国外报道的PAP基因序列相比较,其同源性达99．6％。同时将该基因克隆至原核表达载体pET-5a上,转化大肠杆菌菌株BL21（DE3）－plysS,在0.4mmol/L IPTG的诱导下表达,经SDS－PAGE分析表明,该基因在大肠杆菌中得到了特异性表达,表达蛋白大小为26ku,与预期值相符。Western blotting分析发现该表达蛋白与法国PAP抗血清有特异反应。琼脂双扩散免疫沉淀法鉴定发现表达蛋白与其自己的抗血清及法国的PAP抗血清均能形成免疫沉淀线,且这两条沉淀线在相交处呈融合状态,说明原核表达的该蛋白与法国从商陆叶片中提取出的PAP具有高度的同源性,也说明本试验准确克隆到了PAP基因且在大肠杆菌中得到了表达。     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白(GZFP)的融合蛋白.以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b(+)中,转化宿主菌BL21(DE3),成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET-GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达.     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达(英文)

[目的]研究蜡梅香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMTcDNA的ORF片段,其长度为1196bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中,转化大肠杆菌DH5α获得其原核表达菌株pGSAMT;采用0.01mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66kDa,与预期的26KDa的GST带和42.3KDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达了蜡梅花香基因SAMT。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因（HDAC1）在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSOR...     

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因的表达和抗体制备

猪Sus scrofa domestica日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是引起母猪繁殖机能障碍的重要病原之一,其NS1蛋白参与病毒复制和组装、调节宿主免疫反应功能。提取猪日本乙型脑炎上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增该病毒的NS1基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28（a）上,构建重组原核表达质粒pET-28（a）-JEV-NS1,转化大肠埃希菌Escherichia co1i BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS1蛋白,获得分子量大小为46 kDa的重组蛋白。为了提高表达量,JEV-NS1基因的958~1 245 bp被截短。聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明:JEV-NS1表达量明显提高,纯化后含量达到总蛋白的85%以上。纯化后的蛋白免疫ICR小鼠Mus musculus,制备了小鼠抗JEV-NS1多克隆抗体,western-blotting验证了JEV-NS1的抗原性和抗体的特异性。图6参13     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

澳洲坚果MiSTPP6基因克隆及低温胁迫下表达分析

【目的】克隆澳洲坚果丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6）,并分析其不同组织及低温胁迫下的表达模式,为澳洲坚果PP1家族基因的抗寒分子机制提供理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆MiSTPP6基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况。【结果】从澳洲坚果中克隆获得MiSTPP6基因（GenBank登录号为MT374553）,其cDNA全长2129bp,最大的阅读框（ORF）长度为948bp,编码315个氨基酸残基,含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白为稳定的亲水性蛋白,以丝氨酸磷酸化为主,可能定位于细胞质,属于非分泌型蛋白或膜蛋白,与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二级结构由α-螺旋(占40.00%)、无规则卷曲(占32.38%)、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%）,其三级结构与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%,GMQE值为0.89。MiSTPP6基因在根、茎、叶、刚开放的小花和谢花后30~45d的小果中均有表达,其中,MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高。4 ℃低温胁迫后0.5~24.0h,MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调,整体上呈持续下降的趋势。【结论】MiSTPP6属于PP1家族基因,具有组织表达特异性,可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

3种植物Ran基因的克隆及序列分析(摘要)(英文)

[目的]研究洋葱、大蒜和油菜中Ran基因与拟南芥Ran2基因的同源性,以确定3种植物材料能否作为拟南芥的替代材料研究Ran定位。[方法]采用RT-PCR方法,以拟南芥Ran2的引物分别从洋葱、大蒜和油菜分裂细胞提取的总RNA中扩增出相应片段DNA(AcRan,AsRan,BnRan),经凝胶电泳回收相应PCR产物,克隆到pMD18-T载体上,转化到DH5α中,抽提质粒,经酶切、PCR鉴定确定阳性克隆,将阳性克隆的菌体进行测序、比对分析。[结果]洋葱、大蒜和油菜的Ran基因开放阅读框分别为666、663和666bp;分别编码221、220和221个氨基酸,分子量约24.3kD;与拟南芥AtRan2氨基酸序列同源性分别为99.1%、100%(除末端缺少1个天冬氨酸D外)和96.4%;进化树分析显示洋葱和大蒜Ran基因与拟南芥进化关系更近,其根尖可代替拟南芥根尖研究Ran基因的定位或相关生物学功能。将该实验克隆的3种植物Ran基因序列与收集的14种植物的Ran序列共28种进行氨基酸同源性比对及进化树分析表明,高等植物Ran基因绝大多数在进化树中处于同一位置,同源性高达90%以上(拟南芥AtRan4和水稻OsRan4例外),因此,它们可能在植物细胞分裂过程中起着相似的作用;且3种植物在受动结合域(EBD)和酸性末端(AT)存在不同;而拟南芥AtRan4缺少这2个功能域,可能与AtRan1～3具有不同的作用。[结论]为进一步研究植物Ran基因的生物学功能奠定了基础。