共表达基因Ⅱ型新城疫病毒F、HN蛋白mcDNA载体的构建

为了构建共表达基因Ⅱ型新城疫病毒(NDV)F、HN蛋白的mcDNA载体,试验采用融合PCR技术将合成的Ⅱ型NDV的F基因片段与HN基因片段融合并携带Flag标签,构建pUC-F-HN-Flag基因片段,然后与mcDNA载体MN512A连接构建重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag,采用菌落PCR扩增与酶切方法对重组质粒进行鉴定;利用阿拉伯糖诱导剂诱导重组质粒产生mcDNA;将重组质粒转染至HEK-293T细胞中,收集细胞总蛋白并通过Western-blot与间接免疫荧光试验检测蛋白表达情况。结果表明:通过F、HN基因片段的扩增与融合成功构建pUC-F-HN-Flag基因片段,菌落PCR扩增与酶切结果证明重组质粒连接成功,经诱导剂诱导重组质粒成功产生mcDNA,Western-blot及间接免疫荧光试验均检测到目的蛋白。说明重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag构建成功。     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒HN蛋白球状头部在T4噬菌体衣壳表面的展示

用RT-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因，得到大小约1700bp的片段，将其克隆至pGEM-T easy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果，另设计1对引物带有EcoR I限制位点，用PCR扩增基因主要功能区即编码HN蛋白球状头部的hngd片段，将其分别克隆至pSOC和pR质粒soc基因3′端，重组质粒pSOC-HNGD转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞，以终浓度1mmol／L的1PTG诱导表达，在SDS-PAGE凝胶上检测到相对分子质量大小约67000的目的蛋白条带。随后将重组质粒pR-HNGD转化T4宿主菌E2感受态细胞．阳性克隆用溶菌酶缺陷的T4-Z1感染，用不加溶菌酶的SC平板筛选阳性克隆。经PCR鉴定，hngd片段已整合在T4-Z1的基因组中。纯化后的重组噬菌体T4-Z1-HNGD用SDS-PAGE和Western-blot可检测到67000的特异条带。结果表明，HNGD蛋白成功展示在T4噬菌体衣壳表面，且与NDV抗血清具有良好的反应性。     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因共表达蛋白的免疫原性

用PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个氨基酸构成的短肽为Linker将F及HN基因片段体外连接,与转座载体PFastBacⅠ连接,获得重组质粒PFastBacF—HN,并转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F—HN质粒转染Sf-9昆虫细胞,进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS—PAGE、Western-blot检测显示,获得相对分子质量约123000的蛋白特异条带,说明F-HN重组蛋白表达成功。将共表达蛋白进行进行动物试验,间接血凝试验表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,共表达蛋白二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为80％,这一结果提示利用FHN基因构建的亚单位疫苗具有重要的开发应用价值。     

新城疫病毒F48E9株MNPF和HN基因的真核表达

将新城疫病毒（NDV）F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上，经酶切、PCR鉴定和序列分析，分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒，命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGGHN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞，经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGGM、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG—HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48h后，可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明，NDVF48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达，同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

鹅副粘病毒F和HN基因的克隆及原核表达载体的构建

根据发表的鹅副粘病毒SF02株全基因组序列,分别设计合成一对引物和二对引物,分别采用RT-PCR方法和RT-套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化TGI感受态细胞,经AMP/IPTG/X-Gal平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,结果表明:鹅副粘病毒JS/1/97/Go株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸残基;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符.HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基.将F基因插入到原核表达质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、Xho I多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒;将HN堪因插入原核表达质粒pProEX HTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达HN基因的阳性亚克隆重组质粒.     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的构建

用PCR从含产气荚膜松菌β毒素基因的质粒pXETB2中扩增出β毒素基因，NcoⅠ和BamHⅠ双酶切该β毒素基因，回收0.93kb的β毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含产气荚膜梭菌α毒素基因质粒pXETA1,与上述回收的β毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经NcoⅠ，NotⅠ酶切反应鉴定和苷酸序列分析证实，获得的重组质粒pXCPAB1含有α－β融合基因，重组菌株BL21（CD3）（pXCPAB1)表达产物经ELISA检测和SDS－PAGE分析，表明重组菌株可以表达α－β融合蛋白。     

禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因与鸡IL-18基因真核共表达载体的构建及表达

根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA3的序列，设计1对特异性引物，以重组质粒pcDNA3／IL-18为模板，扩增出具有完整真核表达结构的CMV-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA3／ompH中，经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成功构建了共表达禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因和鸡IL-18基因的重组表达质粒。将共表达质粒转染Cos7细胞，经RT—PCR、SDS—PAGE及Western blotting检测，证明了外膜蛋白H基因及鸡IL-18基因均获得了瞬时表达，为研究禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H的免疫原性和鸡IL-18在基因疫苗中的免疫调节作用奠定了基础。     

新城疫病毒B_(95)株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据 NDV　 HN蛋白已知基因序列设计一对引物 ,以提取的澳大利亚布里斯班 NDV分离株 B95基因组 RNA为模板 ,利用 RT- PCR技术扩增得到一条约 1.9kb的条带。将扩增产物克隆到 PGEM- T- easy载体中 ,并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了 HN基因的阳性重组子 ,随后采用 Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得该基因全长序列 ,并进行同源性分析。 B95株与其他毒株核苷酸同源性为 95 .1%～ 87% ,氨基酸同源性为96 .1%～ 92 .1%。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因的克隆及其鉴定

用自行设计的 1对引物 you1 和 you2 -对 5个传染性支气管炎病毒 (IBV)地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC4)的基因组 RNA进行 RT- PCR,均成功地扩增出预期大小 (约 16 30 bp)的目的片段 ,经 PCR、酶切鉴定为 S1基因。将 5个毒株的 S1基因克隆到 p GEM- T载体中 ,重组质粒经 Eco R 和 Hind 单酶切以及用引物 you1 和 you2 -进行质粒 PCR扩增鉴定 ,证明 IBV- S1基因已成功地克隆到了 p GEM- T载体中。同时 ,为了测序的方便 ,还将 IBV- S1基因作了目的片段 (约 10 6 0 bp)的亚克隆并进行了鉴定     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT—PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素(Ubiquitin)基因，并将其克隆到pGEM—T easy载体，经测序表明，所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达99％。利用设计的融合表达引物，分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白成熟肽基因进行扩增，用重叠区扩增基因拼接法将2个基因片段进行拼接，并插入真核表达载体pcDNA4．0 HISMAXA中，构建出了pcDNA—U—GP5重组质粒。     

广东省新城疫病毒HN基因系统发育分析

用套式RT－PCR一步法扩增了九株NDV地方强毒的HN基因，并对其中3株的HN基因片段进行了克隆、测序及同源性分析。本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析：广东省NDV各毒株与欧美国家I至V基因群明显分离，遗传关系较远。台湾省NDVT各毒株归属为一组并且与中国大陆毒株的遗传距离较近。其中一支FS1／95株不能归类到任何一个基因群中。广东地区从鹅群中分离到的副黏病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有相近的亲缘关系。     

鸡IL-2和新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的融合表达

为进一步研究IL-2对疫苗的免疫增强作用,本研究经PCR扩增分别获得鸡IL-2和新城疫病毒(NDV)HN基因片段,应用分子克隆技术获得含有融合基因IL2-HN的真核表达载体pPICZαA-IL2-HN,重组质粒pPICZαA-IL2-HN线性化后整合入毕赤酵母X-33染色体上,在甲醇诱导下表达融合蛋白,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。SDS-PAGE分析结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为100 ku,Western-blot结果表明目的蛋白具良好的免疫反应性。     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL-18克隆质粒扩增获得了ChIL-18全基因片段，并将其重组到真核表达载体pcDNA3．1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序，鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3．1( )真核表达质粒上；将重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ChIL-18转染COS-7细胞，转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA。SDS-PAGE分析表明，表达产物是与ChIL-18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的高效表达

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中扩增出α毒素基因，用NcoⅠ和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0．95kb的α毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXCPAB2，与 回收的α毒素基因片段连接，转化至受菌BL21（DE3）中。经NcoI,BamHI,NcoI酶反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE）3（pXCPAB2)经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDSPAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合基因，该融合蛋白占菌体总蛋白的22．14％。     

新城疫病毒B95株HN蛋白基因的克隆及序列分析

根据NDVHN蛋白已知基因序列设计一对引物，以提取的澳大利亚布里斯班NDV分离株B95基因组RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增得到一条约1．9kb的条带。将扩增产物克隆到PGEM—T—easy载体中，并对重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了HN基因的阳性重组子，随后采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得该基因全长序列，并进行同源性分析。B95株与其他毒株核苷酸同源性为95．1％～87％，氨基酸同源性为96．1％～92．1％。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。