猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

以伪狂犬病病毒(Bartha-K61)为载体正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白重组疫苗的构建

构建以伪狂犬病病毒Bartha-K61株为载体的正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白的重组活载体疫苗.将eGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Mlu Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8AA-eGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的滴度(TCID_(50))为10~(8.125)/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组Bartha-K61的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制与开发奠定基础.     

表达日本乙型脑炎病毒E蛋白重组伪狂犬病病毒SA215（E）的构建

将日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)CQRC-1株的E基因通过RT-PCR产生,克隆到pMD18-T simple载体中,再亚克隆到转移载体pPI-2,EGFP中,命名为PPE.PPE质粒和伪狂犬病毒(PRV)SA215株DNA通过磷酸钙共转染方法转染到Vero细胞上.通过有限稀释法、噬斑纯化、PCR检测、Southern杂交、West杂交,获得了表达JEV E蛋白的重组伪狂犬病病毒,命名为SA215(E).结果表明,SA215(E)在生长曲线、噬斑形态及大小、在Vero细胞上的病变与PRV SA215一致.安全性试验表明,SA215(E)对小鼠和兔具有较高的安全性,SA215(E)具有很强的免疫原性.接种兔能预防致死剂量的PRV Fa肌肉内攻毒;接种小鼠能预防致死剂量的JEV cQRC-1株腹膜内攻毒.表明该重组病毒是养猪业控制伪狂犬病和乙脑最适合的候选疫苗株之一.     

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。     

重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)对绵羊的安全和效力试验

为了验证表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)的安全性和免疫原性,将10只5～6月龄健康绵羊分成三组,安检组(3只)肌注108.0PFU/只、效检组(4只)肌注106.0 PFU/只,3只作为不接种对照组.接种后14 d,效检组与对照组每只臀部肌注伪狂犬病病毒"双城系"猪源强毒S株103 LD50,结果效检组全部保护,对照组全部死亡,安检组未见异常.结果表明,重组病毒完全符合伪狂大病活疫苗制造及检验规程中对疫苗的安全和效力检验标准.     

猪伪狂犬病毒变异株(Fujian-LY)对免疫仔猪的致病性研究

本实验室2014年从福建省龙岩市某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒变异株,命名为PRV Fujian-LY株。为了研究Fujian-LY株对免疫仔猪的致病性,将8头20龄的PRV抗原、gE抗体均为阴性,gB抗体均为阳性仔猪随机分为3组,其中2组(每组3头猪)分别通过肌肉注射和滴鼻接种Fujian-LY株,第3组2头仔猪做阴性对照。试验仔猪接种病毒24h后体温均开始升高,随着病程发展,呼吸系统症状明显,滴鼻接种组仔猪发病明显快于肌肉注射组,所有攻毒仔猪虽均有发病但未出现死亡。通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养、易感动物感染试验及gE抗体ELISA检测证实Fujian-LY株人工攻毒试验成功。gE抗体检测结果表明所有攻毒仔猪攻毒后7dPRV gE抗体开始阳转。对发病仔猪剖检可见,脑积液明显增多,脑膜血管充血,并伴有出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片观察结果显示发病仔猪脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围"血管套"现象,其他主要脏器也均有明显的病理变化。试验结果表明PRV Fujian-LY株为伪狂犬病毒强毒株。     

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒弱毒株LY株的分离鉴定

从辽阳某猪场的10日龄仔猪中分离到1株病毒,经纯化后测得其毒价为107.29TCID50/mL.细胞中和试验表明,该病毒能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清所中和.电镜下可见到典型的疱疹病毒粒子,具有囊膜及外周纤突.所分离的病毒对氯仿、胰蛋白酶、乙醚敏感,在pH5.0～9.0下稳定,56℃ 30 min可以灭活.应用特异性引物,通过PCR能扩增出伪狂犬病病毒1 240 bp的gD基因.分离病毒对3日龄乳鼠有一定的致病力,但对家兔、3～5日龄仔猪及妊娠母猪都有很高的安全性.用不同剂量的病毒培养液肌肉注射于3～5日龄仔猪,14 d后用105.7TCID50伪狂犬病病毒强毒攻击,所有试验仔猪均可得到有效保护.用分离毒免疫母猪,其后代可获高滴度的母源抗体,15日龄的仔猪能抵抗105.7TCID50强毒的攻击.试验的结果初步说明,所分离的病毒为伪狂犬病病毒(命名为PRV LY株),并可能是一株弱毒株,而且具有很好的免疫保护作用.     

伪狂犬病毒流行毒株的抗原性和血清中和特性分析

2011年以来,我国多个省份伪狂犬病免疫猪群相继暴发伪狂犬病疫情。为了探明伪狂犬病毒(PRV)流行毒株是否存在抗原变异,本研究从3个规模猪场3种PRV商品疫苗免疫的健康猪群中采集30份血清,经检测PRV gB ELISA抗体均为阳性,gE ELISA抗体均为阴性。采用PRV新流行毒株ZJ-01株和传统的LA毒株分别进行血清中和抗体测定,结果显示,3个毒株活疫苗免疫血清与ZJ-01株中和抗体效价明显低于其与LA株中和抗体效价。同时,ZJ-01株抗血清与ZJ-01株和LA株的中和抗体效价相似,其变异系数R值为0.279⁰.413,证明PRV分离毒株ZJ-01抗原性发生明显变异。本研究为伪狂犬病的防控提供了重要依据。     

伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础.     

Molecular biology of pseudorabies (Aujeszky's disease) virus.

In this review, some of the aspects concerning the molecular biology of pseudorabies virus (PrV), the causative agent of Aujeszky's disease, will be discussed. It will mainly focus on new findings concerning viral glycoproteins, factors determining PrV virulence, the problem of PrV latency and the development regarding genetically engineered vaccines.