牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因的真核表达

为构建牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒,以牛瑟氏秦勒虫基因组DNA为模板,应用SOE—PCR技术得到牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因,将其先克隆到pMD18T—Simple载体,再亚克隆到真核表达载体pVAX1中,得到重组质粒pVAX1—2p33。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RTPCR和IFA进行鉴定。结果表明,牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒pVAX12p33构建成功并可以在BHK-21细胞中表达。本试验结果为p33双拷贝基因的免疫学研究奠定了基础。     

鸡催乳素和抑制素-α亚基重组蛋白的构建及表达

将鸡催乳素 (PRL)和抑制素 - α亚基 (INB- α)基因编码序列重组为融合基因 ,制备了同时包含这 2种激素基因的融合蛋白。通过 PCR和分子克隆的方法首先将全部粤黄鸡 PRL成熟肽 c DNA克隆到载体 p RSET A的 Bgl 和 Eco R 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p PRL- RSET。鸡 INB- α片段经扩增后分别被克隆到质粒 p RSET A和 p PRL- RSET的 Nhe 和 Xho 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p INB- RSET和 p INB- PRL。以上重组质粒构建的正确性分别由各特定引物组合扩增的 PCR产物长度、特定限制性内切酶消化各重组质粒所得产物长度以及对各质粒的测序结果得到验证。重组质粒 p PRL- RSET和 p INB- PRL 转化 E.coli BL2 1(DE3)株 ,IPTG诱导后所表达的产物经 SDS- PAGE显示 ,其分别与所预期的重组蛋白分子大小相符。质粒 p PRL - RSET和 p INB- PRL的表达产物和用 Ni- NTA凝胶纯化的 2重组蛋白产物都可与抗鸡 PRL 抗体产生特异的免疫印迹 ,并且表达菌裂解液和相应纯化蛋白的免疫印迹处于同一位置。结果说明 ,试验已成功完成了鸡 PRL、INB-α及 2者融合蛋白的构建、表达和纯化     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

猪源益生菌EP株突变株EP△asd的构建和初步应用

为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。     

表达绿色荧光和红色荧光蛋白重组新城疫病毒的构建

试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建。通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(Ds Red)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒p AI4-2FHN-GRFP。该质粒与p CI-NP、p CI-P和p CI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞后,获得可同时表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组新城疫病毒。拯救病毒在SPF鸡胚中繁殖传代,通过RT-PCR验证,并检测重组病毒的生物学活性和外源蛋白的表达效率。结果显示:重组病毒在鸡胚内传3代后,鸡胚尿囊液HA效价稳定在8 log_2,感染细胞24 h、36 h、48 h后在荧光显微镜下观察到EGFP与Ds Red的荧光亮度逐渐增强,且相同时间内红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白表达量相似。重组病毒的构建为新城疫病毒作载体用于多联多价疫苗的研发提供了参考。     

犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

重组宁乡猪生长激素真核表达质粒(pCI-GH-EGFP)的构建及其在Vero细胞中的表达

为了构建宁乡猪生长激素(GH)真核表达系统,并转染非洲绿猴肾细胞系(Vero)观察其表达情况,试验选用宁乡猪脑垂体组织总RNA反转录获得的c DNA为模板,克隆宁乡猪生长激素(nxGH)基因序列,将其定向插入p CI载体构建重组质粒p CI-GH,并将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因酶切后连入质粒p CI-GH中,构建真核表达载体p CI-GH-EGFP。将该重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞,倒置荧光显微镜下观察到GH-EGFP融合蛋白可稳定表达。结果表明:宁乡猪生长激素基因编码区序列含有1个由651个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),编码216个氨基酸残基。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响，以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出FILIP1L基因，克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因，通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况，并研究其抗病毒功能。结果：成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒，转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后，FILIP1L基因的mRNA表达显著上调；过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制；下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上，FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制，研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。     

含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2．EGFP．VP2。采用磷酸钙转染系统，将pPI-2．EGFP．VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒，将其中一株（命名为SA215-B）DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功，并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约93ku的融合蛋白，同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性，表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。     

分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)EP0蛋白进行原核表达并制备其多克隆抗体,试验以PRV HeN1毒株为模板,构建了EP0基因原核重组质粒pET28a-EP0,经测序鉴定后,将pET28a-EP0重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以表达重组蛋白His-EP0;确认重组蛋白His-EP0表达后,用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,进行Western-blot测定,用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光法测定多克隆抗体的特异性。结果表明：EP0蛋白原核表达成功,His-EP0蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白形式表达,大小在55～70 ku之间;EP0蛋白多克隆抗体制备成功,抗体效价在1∶160 000以上,且能与表达的重组蛋白His-EP0及PRV感染的细胞发生特异性反应。说明试验成功表达了EP0蛋白,并成功制备了EP0蛋白多克隆抗体,抗体效价可达到1∶160 000以上,且特异性较好。     

猪流感病毒NP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建与表达

以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.     

瑟氏泰勒虫p23与牛IL-18复合基因真核表达载体的构建与瞬时表达

为构建瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒,以pMD-18T-p23和pMD-18T-IL-18克隆质粒为模板,应用重组PCR技术得到瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因,将其先克隆到pMD-18-T载体,再亚克隆到真核表达载体pVAXⅠ中,得到重组质粒pVAXI-P23-IL-18。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RT-PCR和IFA进行鉴定。结果表明,瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒pVAXIP23-IL-18构建成功,可在BHK-21细胞中表达。本试验为p23-IL-18复合基因的免疫学研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究

为研究表达鹅α干扰素(GoIFN-α)基因重组活载体疫苗对抑制病毒增殖活性,本实验从植物血凝素刺激的延边白鹅外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增gIFN-α基因,其大小为576 bp.将其与LacZ表达盒串联克隆于pSY681质粒中构建pSY681-IFN-α-LacZ转移重组质粒.采用脂质体将重组质粒转染于预感染禽痘病毒(FPV) 017株的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝/白斑筛选获得重组禽痘病毒rFPV-IFN-α.采用间接免疫荧光和western blot方法对重组毒鉴定结果显示,GoIFN-α基因在CEF中获得表达,分子质量约为29 ku.表达的CoIFN-α对鹅细小病毒在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用.本研究为进一步开展GoIFN-α基因重组FPV活载体疫苗的体内试验奠定了基础.