高温胁迫对杂交狗牙根叶片和根系蛋白质差异表达的影响

为了揭示蛋白质的差异表达和C_4植物杂交狗牙根叶片和根系对高温抗性差异的关系,研究了0、1、6、24d的高温胁迫对杂交狗牙根(‘Tifdwarf’)叶片和根系抗热相关生理指标和可溶性蛋白差异表达的影响。通过草坪质量、光化学效率、叶绿素和类胡萝卜素含量的分析,发现与1、6d的高温胁迫相比,24d高温胁迫条件下,叶片的伤害显著增加。通过电解质外渗分析发现,与叶片相比,高温对根系的伤害更大。结合标准蛋白,笔者发现叶片中热激蛋白(heat shock protein,Hsp),Hsp90、Hsp83、Hsp75、Hsp68、Hsp60、Hsp49,根系中Hsp90、Hsp75、Hsp68、Hsp60的差异表达,可能与杂交狗牙根叶片和根系对高温抗性的差异有关。研究结果对于筛选C_4植物抗高温的分子标记以及植物根系蛋白质组学的研究具有重要意义。     

高温胁迫下桃小食心虫热激蛋白Hsp90和Hsp70基因的克隆及序列分析

桃小食心虫(Carposina sasakii Matsumura)是果树上重要的食心虫类害虫,热激蛋白Hsp90和Hsp70在昆虫抵御温度胁迫反应中具有重要作用。采用RT-PCR方法克隆获得了高温胁迫下桃小食心虫热激蛋白Hsp90和Hsp70基因c DNA部分序列,并对其进行分析,为深入揭示桃小食心虫对环境适应的分子机理提供理论依据。已获得的桃小食心虫热激蛋白Hsp90基因(Gen Bank登录号:KJ139642)序列长420bp,编码139个氨基酸残基,推导的氨基酸序列中含有热激蛋白90家族的一段序列为YSNKEIFLRE的特征序列,并且c DNA序列在N端具有Hsp90基因保守的ATPase结构,该序列与天蚕(Antheraea yamamai)和柞蚕(Antheraea pernyi)等昆虫的氨基酸序列一致性高达99%。已获得的Hsp70-1基因(Gen Bank登录号:KJ139643)和Hsp70-2基因(Gen Bank登录号:KJ139644)序列长均为305bp,编码101个氨基酸残基。Hsp70-1基因推导的氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)的氨基酸序列一致性为94%,Hsp70-2基因推导的氨基酸序列与小菜蛾(Plutella xylostella)和烟草夜蛾(Manduca sexta)等昆虫的氨基酸序列一致性为96%。     

黑麦热激蛋白ScHsp90-1基因的克隆及表达分析

本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因,暂命名为ScHsp90-1,并对其序列进行分析。结果显示,该基因cDNA序列全长2 103 bp,共计编码700个氨基酸,蛋白质分子量约80.47 k D。序列同源性分析表明,ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高;进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的Ta Hsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明,ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应,其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。     

Hsp90基因在南方根结线虫和番茄中的表达研究

Hsp90基因是真核生物中广泛存在且非常保守的热激蛋白基因家族中的重要成员,在生物的抗逆胁迫过程中起重要作用.从番茄基因组扩增Hsp90基因,连接到载体pCAMBIA1302上,构建了表达载体pCAM-Hsp90,利用实时定量荧光技术检测了番茄接种南方根结线虫后Hsp90基因的表达水平,结果表明:在20～25dpi后番茄根部SI-Hsp90基因大量表达.此外,南方根结线虫的雌虫和二龄幼虫J2的Mi-Hsp90基因在高温和低温胁迫时表达量都高于对照,而且在35℃时表达量要高于4℃时的表达量,在J2中的表达量高于雌虫的表达量.说明Hsp90基因在番茄抗线虫侵染以及线虫适应环境方面起到非常重要的作用.南方根结线虫J2在35℃高温下Hsp90的高表达使其能够保持较高的活力并侵染番茄的根部,从而使南方根结线虫更适合在较高温度下生存.本试验进一步证明热激蛋白在番茄抗线虫侵染和线虫对环境的适应性过程中起到重要作用,同时为利用生态控制的方法防治根结线虫病害提供理论依据.     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。     

中国大鲵热激蛋白基因Hsp90的克隆及极端温度胁迫下的表达研究

旨在克隆中国大鲵热激蛋白90基因(heat shock protein 90,简称Hsp90),并探讨该基因在低温、高温胁迫下的响应机制及其分子机制,分析Hsp90基因与中国大鲵对温度胁迫的关系。利用中国大鲵皮肤转录组测序获得的热激蛋白基因部分序列,克隆获得中国大鲵热激蛋白基因家族中Hsp90B1、Hsp90AA1基因的cDNA全长序列,分别将其命名为CgHsp901、CgHsp902,其中CgHsp901基因的开放阅读框大小为2 388 bp,编码795个氨基酸;CgHsp902的开放阅读框大小为2 184 bp,编码727个氨基酸。2个基因的理论分子量都为90 ku,等电点分别为4.81、5.32。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测这2个基因在中国大鲵心脏、肝脏、胃、胰腺、肌肉、皮肤和肠道7个不同组织中在低温、高温胁迫下mRNA表达量的差异。结果表明,在低温(0、5℃)、高温(20、25℃)下胁迫24、48 h后,2个基因在大鲵皮肤、肌肉和心脏组织中的表达量整体表现为显著上调的趋势,低温时2个基因在肠道、胰腺、胃中的表达量出现下调,高温时则上调,但差异不显著。结果说明,CgHsp901、CgHsp902基因在大鲵抵抗高温、低温胁迫的过程中起着重要作用     

磷脂与Hsp90相互作用的荧光和红外光谱

为研究磷脂酰胆碱(PC)与热休克蛋白90(Hsp90)的相互作用机制,分别采用荧光光谱和红外光谱法研究Hsp90内源荧光的变化和磷脂主要基团的变化。结果显示:PC对Hsp90内源荧光有较强的猝灭作用,PC对Hsp90的猝灭属于形成复合物产生的静态猝灭,结合位点数为0.92,结合的主要作用力为氢键和范德华力;Hsp90与PC的相互作用发生在磷脂极性头端和非极性侧链上,并使磷脂的结构发生改变。磷脂可以稳定地与Hsp90结合。     

亚洲玉米螟交变温度下热休克蛋白基因(HSPs)的表达分析

热休克蛋白基因(heat shock proteins,HSPs)Hsc70及Hsp90是目前认为与昆虫抵御环境压力及温度适应有关的指标,为了检测较大日温差对亚洲玉米螟滞育幼虫抗寒性的影响,本研究模拟东北地区昼夜温差效应,对亚洲玉米螟滞育幼虫进行6h的-20℃低温诱导和随后18h的4℃恢复处理,在不同的时间点测定其过冷却点,使用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测Hsc70及Hsp90的相对表达量,并利用SPSS对最终的表达量进行统计学分析,发现Hsc70及Hsp90在低温诱导阶段的表达出现下调,且维持在一个较低的表达水平(低温诱导0~3h)。直至低温诱导6h,其表达量开始回升,此时,进行4℃恢复处理,发现起初恢复阶段Hsc70及Hsp90的表达明显下调,而在恢复1h后2种热休克蛋白表达量逐渐增加,恢复3h时达到表达量的峰值,而后又逐渐下降。此结果说明,Hsc70及Hsp90是温度敏感性蛋白,其表达量受交变温度的影响显著,并且低温有利于其表达量维持在较低水平。对Hsc70及Hsp90表达量变化规律与过冷却点变化规律进行相关性分析可知,Hsc70表达量的变化规律与过冷却点变化规律显著相关,Hsp90则相关不显著。此结果表明Hsc70可能对亚洲玉米螟抗寒性起到了重要作用。     

异色瓢虫胁迫对棉铃虫生长发育及压力蛋白基因表达的影响

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历期、雌雄蛾寿命、总寿命)和变态发育(蛹重、化蛹率、羽化失败率、卷翅率)指标;设置长时(1龄幼虫至3日龄成虫)和短时(15 min至6 h)异色瓢虫胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测棉铃虫压力蛋白基因(即热激蛋白基因)Hsp70和Hsp90及热激同源蛋白基因Hsc70在胁迫后的表达水平变化。【结果】在捕食性天敌异色瓢虫的胁迫下,棉铃虫幼虫历期、蛹期、雌雄蛾寿命、总寿命均显著性缩短,蛹重和化蛹率显著性下降,成虫卷翅率显著性升高,而羽化失败率无显著性变化。在不同食源的天敌胁迫下,棉铃虫幼虫历期在异色瓢虫取食蚜虫时最短,蛹历期在瓢虫取食棉铃虫卵时最短,总寿命在瓢虫取食虾卵时最短,而雌雄蛾寿命在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异;棉铃虫成虫卷翅率在瓢虫取食棉铃虫卵时最高,而蛹重、化蛹率、羽化失败率在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异。压力蛋白基因Hsp70和Hsp90在短时胁迫下(Hsp70:30min至3 h;Hsp90:15 min、1.5 h、2 h、6 h)表达水平显著性上调,热激同源蛋白基因Hsc70在长时胁迫下(5龄幼虫、预蛹、雄蛹、雌蛾阶段)表达水平显著性上调。【结论】在面对捕食性天敌异色瓢虫长时胁迫作用下,棉铃虫各生长发育阶段均出现缩短的现象,即棉铃虫为躲避被捕食风险表现出了发育加速的现象,而快速的生长发育在一定程度上干扰了变态发育,导致蛹重和化蛹率下降,成虫卷翅率提高,符合权衡效应。棉铃虫对不同食源的天敌胁迫具有不同程度的敏感性,即棉铃虫对潜在的捕食风险可能存在一定的分级能力,但这种分级能力没有得到规律性体现。异色瓢虫胁迫能够引起棉铃虫分子层面的生理反应,导致压力蛋白基因的表达上调,其中压力蛋白基因Hsp70和Hsp90受到短时胁迫的反应较为明显,而热激同源蛋白基因Hsc70受到慢性胁迫刺激的反应更为显著。     

板栗Hsp90基因家族的鉴定及在胚珠发育过程中的表达分析

  目的  热激蛋白（Hsp90）是一种在细菌、植物、动物中均广泛存在的高度保守的蛋白质分子，在植物应激反应和生长发育等过程中发挥着重要的作用。板栗作为我国重要的坚果树种，雌雄花比例不同、授粉受精困难及胚败育等现象致使板栗单产低，严重制约板栗的产量。近期有研究发现Hsp90基因家族参与植物的胚形成，本研究首次对板栗中Hsp90基因家族进行鉴定及表达分析，旨在揭示Hsp90基因家族的功能及其在授粉受精和胚珠发育过程中的作用，进而为提高板栗产量提供理论依据。  方法  利用生物信息学方法对板栗Hsp90基因家族成员进行了鉴定，分析家族成员的理化性质、基因结构、进化关系、启动子元件。基于转录组数据分析CmHsp90基因在板栗胚珠不同发育时期的表达情况。  结果  本研究在板栗中共鉴定到10个CmHsp90基因，该基因家族成员的编码区（CDS）长度范围是2 112 ~ 2 481 bp，含有4 ~ 22个外显子，编码703 ~ 826个氨基酸，相对分子量范围为80.67 ~ 94.21 kDa，等电点pI范围介于4.81 ~ 5.26；不稳定系数介于36.15 ~ 46.75之间，除CmHsp90-6、CmHsp90-4、CmHsp90-9外，其他基因编码的蛋白质相对比较稳定。对CmHsp90基因家族蛋白进行亚细胞定位预测发现:5个成员（CmHsp90-1、CmHsp90-4、CmHsp90-5、CmHsp90-9、CmHsp90-10）定位到了细胞质上，2个成员（CmHsp90-7、CmHsp90-8）定位到了内质网上，其余3个成员分别定位到细胞核（CmHsp90-3）、线粒体（CmHsp90-2）和叶绿体上（CmHsp90-6）上。对CmHsp90基因家族蛋白信号肽预测发现，仅CmHsp90-7和CmHsp90-8存在潜在的信号肽位点。CmHsp90基因家族蛋白的motif、保守结构域基本一致，均包含Hsp90结构域（PF00183）和HATPase_C结构域（PF02518）。基于系统进化树分析，10个CmHsp90家族蛋白被分为5个组。对CmHsp90基因家族启动子区域进行顺式作用元件预测，发现光响应元件是CmHsp90基因家族启动子上的主要调控元件，其次为ABA响应元件，此外，有4个基因（CmHsp90-1、CmHsp90-5、CmHsp90-7、CmHsp90-8）存在温度响应元件。通过对板栗胚珠不同发育阶段的RNA-seq数据进行分析发现:除CmHsp90-3基因外，其他基因在受精前胚珠中的表达量均高于受精后胚珠；CmHsp90-2、CmHsp90-4、CmHsp90-5、CmHsp90-7、CmHsp90-8、CmHsp90-9、CmHsp90-10基因在发育胚珠中的表达量高于败育胚珠。  结论  CmHsp90基因在胚珠不同发育过程中的表达存在差异，在同一子房内发育胚珠和败育胚珠中的表达情况也不尽相同，研究结果为下一步研究CmHsp90基因在板栗授粉受精以及胚发育过程中的具体作用奠定理论基础。