Bacillus thuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中,最主要的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insectici-dal protein,Vip)。当前,大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类,随着这些转基因作物种植面积的扩大,害虫对这些较为单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。Vip3是Vip杀虫蛋白中的一类,不形成蛋白晶体,和ICPs在进化上没有同源性;其对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用,抗虫谱较广。目前,已经把Vip3基因导入了水稻、玉米和棉花等多种作物中,为作物抗虫育种、延缓害虫产生抗性和减少作物产量损失等带来新的前景。     

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。     

Toxicity and binding analyses of Bacillus thuringiensis toxin Vip3A in Cry1Ac-resistant and-susceptible strains of Helicoverpa armigera(Hübner)

The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein, Vip3 A, represents a new family of Bt toxin and is currently applied to commercial transgenic cotton. To determine whether the Cry1Ac-resistant Helicoverpa armigera is cross-resistant to Vip3 Aa protein, insecticidal activities, proteolytic activations and binding properties of Vip3 Aa toxin were investigated using Cry1Ac-susceptible(96S) and Cry1Ac-resistant H. armigera strain(Cry1Ac-R). The toxicity of Vip3 Aa in Cry1Ac-R slightly reduced compared with 96 S, the resistance ratio was only 1.7-fold. The digestion rate of full-length Vip3 Aa by gut juice extracts from 96 S was little faster than that from Cry1Ac-R. Surface plasmon resonance(SPR) showed there was no significant difference between the binding affinity of Vip3 Aa and BBMVs between 96 S and Cry1Ac-R strains, and there was no significant competitive binding between Vip3 Aa and Cry1 Ac in susceptible or resistant strains. So there had little cross-resistance between Vip3 Aa and Cry1 Ac,Vip3A+Cry proteins maybe the suitable pyramid strategy to control H. armigera in China in the future.     

苏云金芽孢杆菌Vip3Aa10毒素结合肽的筛选及活性测定

【目的】Vip3A是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在对数生长期产生并分泌到胞外的对鳞翅目昆虫有较广杀虫谱的毒素,其在敏感昆虫中肠上的结合受体尚未得到鉴定。利用噬菌体展示技术,论文试图从肽库中筛选到能与Vip3A毒素特异性结合的多肽,为研究Vip3A毒素的杀虫模式提供线索。【方法】将构建的pET28a-Vip3Aa10表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,用亲和纯化的方法制备Vip3Aa10,并用胰蛋白酶活化和离子交换层析进一步纯化。以活化的Vip3Aa10毒素为诱饵,经“吸附-洗脱-扩繁”4轮条件逐渐严格的淘选,从噬菌体随机肽库中筛选能特异性地与活化的Vip3Aa10结合的噬菌体。以筛选到的噬菌体基因组DNA为模板,经PCR扩增和测序,获得插入到噬菌体上的外源基因的序列,并推导出相应多肽的氨基酸序列。将化学合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)刷状缘膜囊泡共育后,用免疫印迹方法检测多肽对活化的Vip3Aa10与BBMV结合的影响。将合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起涂布在饲料表面,晾干后,每孔放1只1龄的甜菜夜蛾幼虫。6 d后统计昆虫死亡情况。【结果】在25℃条件下用IPTG诱导含pET28a-Vip3Aa10质粒的大肠杆菌BL21（DE3）可以表达出可溶性的Vip3Aa10蛋白。经亲和纯化、胰蛋白酶活化以及离子交换层析后,可得到较纯的活化的Vip3Aa10。以活化的Vip3Aa10为诱饵,经过4轮条件逐渐严格的淘选,从十二肽库中筛选出9条多肽,其中3条多肽的丰度较高,分别命名为P12-1、P12-2和P12-3,从七肽库中筛选出5条多肽,其中1条多肽的丰度较高,命名为P7-1。结合试验和杀虫活性测定试验结果表明,P12-2和P7-1多肽能不同程度地抑制Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合,以及抑制Vip3Aa10的杀虫活性。【结论】用噬菌体展示技术筛选的多肽P7-1能显著性地抑制Vip3Aa10与刷状缘膜囊泡的结合,可降低35%以上的Vip3Aa10的杀虫活性。     

一株对马铃薯瓢虫幼虫具有高活性的苏云金杆菌新菌株

从河北省土壤中分离了一株苏云金杆菌WZ 9,通过对其生物学特性和杀虫活性的研究发现,该菌株对马铃薯瓢虫幼虫具有特异性高效杀虫活性,LC50为2.95×107细胞/mL;而对鳞翅目的菜青虫、棉铃虫、玉米螟、甜菜夜蛾、黄粉虫等几种重要害虫均无效。     

苏云金芽胞杆菌cry1Aa19基因的克隆、表达及杀虫活性分析

研究根据cry1Aa类基因的全长序列设计全长引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株LS-R-21的基因组DNA为模板扩增出片段大小为3 600 bp的cry1Aa的全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pEB相连接获得含有cry1Aa全长基因的重组质粒pEB-cry1Aa,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,诱导表达出132 ku的蛋白。该蛋白由1 175个氨基酸组成,其分子质量为132.9964 ku。该基因核苷酸序列已在GenBank中登录,登录号为HQ685121,并且被国际基因命名委员会正式命名为cry1Aa19。杀虫活性测定结果表明,cry1Aa对小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50为1.18μg.mL-1。该基因的获得将为害虫抗性研究及高效工程菌的构建提供了重要的试验材料。     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIP)Vip3A是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis,Bt)在营养生长对数中期开始分泌的一类杀虫蛋白,其广泛存在于Bt菌中,现已发现8类37种,在遗传上比较保守。与杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)相比,Vip3A蛋白具有热不稳定性,其杀虫机理与ICPs也不同,并且Vip3A蛋白与不同Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用,这为筛选新的杀虫基因、构建特异高毒力工程菌和转基因抗虫植物以及杀虫分子机理等基础研究提供了新的思路。     

苏云金杆菌Bt-8的培养特性及杀虫活性分析

[目的]明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt-8的菌株生物特征及其杀虫活性,为其工业化生产提供参考.[方法]通过LB培养基培养观察3株苏云金杆菌Bt-8、Bt2671和Bt7-9菌株生长特征,并比较分析其内生质粒和晶体蛋白的种类.发酵培养基培养分离3株菌株的晶体蛋白,通过生物活性测定和国家标准中描述的方法分析毒素蛋白浓度和生物效价及杀虫谱.[结果]Bt-8具有典型的苏云金杆菌培养特征,营养生长后期形成菱形至椭圆形晶体蛋白,但孢子稳定时间较短,容易二次萌发.Bt-8携带24、16、8和7kb4种质粒,大分子晶体蛋白基因主要为cry1Ac和cry1Ab.杀虫活性分析结果表明,Bt-8培养活菌数低于原分离菌株Bt2671,但晶体蛋白代谢量极显著提高(P<0.01),生物效价较Bt2671提高30.4%,对小菜蛾、稻纵卷叶螟和茶尺蠖等多种鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性.[结论]Bt-8菌株较原生产菌株Bt2671的生物效价高,产毒素蛋白能力较强,杀虫谱较广,具有开发高含量Bt制剂的潜力.     

纯化的苏云金杆菌00-50-5晶体和芽孢对甘蓝尺蠖的杀虫活性

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)00-50-5菌株可以高效地杀死多种鳞翅目昆虫害虫。为了深入研究该菌的治病机理和作用方式,首先需要分离和纯化晶体和孢子,研究它们的杀虫活性。本研究用纯化后的00-50-5菌株晶体和芽孢,比较它们对昆虫甘蓝尺蠖(Trichoplusia ni)的杀虫活性。初步的活性测定结果证实,在用100μg/mL浓度处理48 h后,00-50-5菌株纯晶体以及晶体和孢子混合物都能够杀死二龄甘蓝尺蠖幼虫,死亡率达100%,纯芽孢则无毒杀效力。致死中浓度(LC50)的测定结果表明,Bt 00-50-5菌株纯晶体的杀虫活性(LC50=0.32μg/mL)高于晶体和孢子的混合物(LC50=0.48),然而纯孢子的杀虫活性是非常低的(LC50大于500.00)。因此,00-50-5的晶体主要负责引起幼虫的死亡。     

苏云金芽胞杆菌对淀粉塑料膜降解的促进作用

苏云金芽胞杆菌菌粉,玉米淀粉与线性低密度乙烯共混制得淀粉塑料,通过地理降解和摇床快速降解试验研究了淀粉塑料中淀粉的降解率。结果发现地理降解１２０ｄ后含５％菌粉和５０％淀粉的薄膜淀粉降解率达到８９．５２％,扫描电镜观察大部分淀粉颗粒破碎,出现许多小孔。不加菌粉的淀粉降解率只３５．４８％,表明添加的菌粉对淀粉降解有的促进作用。     

苏云金杆菌和培养基氨基酸的比较分析

通过分析伴孢晶体、芽孢、培养基及发酵液等的氨基酸比例，初步得到一些有关氨基酸参与代谢的资料．在发酵过程中，氨基酸既有累积又有消耗，特别是谷氨酸明显地被消耗；不同原料的氨基酸比例相差很大．这很可能是培养基影响杀虫毒力的主要原因之一．同一出发菌株８０１０（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒｋｕｒｓｔａｋｉ８０１０，简称８０１０）分离得到的３号、５号和７２号菌株氨基酸比例稍有不同，它们与有关资料报道的其它菌株的氨基酸比例有较大不同．伴抱晶体和芽孢之间的氨基酸比例明显不同．Ｂｔ８０１０菌种发酵需要供给较多的谷氨酸．     

蜡质芽孢杆菌12-14菌株对苏云金杆菌增效作用的研究

从土壤中分离的Bc1 2 - 1 4菌株是一株对Bt具有明显增效作用的蜡质芽孢杆菌。对Bc1 2 1 4菌株发酵上清液进行增效性测定结果表明 ,该菌株对部分Bt菌株具有明显的增效作用。Bc1 2 1 4菌株上清液对BtHD 1 580菌株增效 ,可提高 82 % ;而Bc1 2 1 4 Bt940 0 1组合 ,与Bt940 0 1纯培养相比 ,在培养基A上的发酵效价和晶体蛋白含量分别为 5 0 0 0IU·μl- 1 、5 4mg·ml- 1 ,提高 1 8%和 2 2 %。     

Bt WDG稳定性与防治小菜蛾试验

对苏云金杆菌水分散颗粒剂(Bt WDG)的稳定性、防治效果、技术指标等的研究结果表明,水分散颗粒剂的平均降解率为15.1%,优于可湿性粉剂的19.8%;小区试验,水分散颗粒剂与可湿性粉剂在同样剂量下防效相当;大田示范,水分散颗粒剂防效略优于对照药剂;各项技术指标均达到水分散颗粒剂企业标准的要求.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究

 通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析，以及与已知Cry蛋白比较，设计了6对特异性引物，PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上，导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性，研究结果表明含有第1-685位和含有第22-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性，与全长Cry1Ba3蛋白相比，没有改变；含有第54-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低；而含有第22-627位和含有第85-655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区在第22-655位氨基酸之间。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

一株对蚊子幼虫高效的Bt新菌株的特性研究

苏云金芽胞杆菌WFS-97菌株是从土壤中筛选出的对蚊子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株,本研究通过对该菌株的形态特征、培养特性及杀虫基因型的研究,了解其作为杀蚊制剂的开发应用潜力.在光学显微镜下,观察该菌株产生球形伴胞晶体,SDS-PAGE检测显示主要表达27 kDa主要蛋白条带,此外,还有131、79、43和31 kDa...     

Bt-15A3在不同温度下对小菜蛾的杀虫活性

采用菜叶法，在5个温度梯度下分别测试了Bt-15A3不同稀释度的杀虫活性，结果表明：环境温度明显影响Bt-15A3的杀虫活性，Bt-15A3的最适应用温度是32－40℃，可应用的温度范围为16－40℃，制剂的稀释倍数越大，对环境温度的变化越敏感。     

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物.结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法.     

苏云金芽胞杆菌微胶囊剂的制备及其抗紫外线降解活性研究

以邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)为囊材,以Bt原粉为囊芯,添加紫外线吸收剂,制备Bt微胶囊刺,并用生物测定的方法对Bt微胶囊剂抗紫外线降解能力与Bt原粉进行比较.结果表明,Bt微胶囊剂热贮(54±2℃,14d)后效价下降约5%;经紫外线照射处理后,Bt原粉效价活性保留率为24.30%,Bt微胶囊剂效价活性保留率为67.60%,抗紫外线降解能力比Bt原粉提高约43%.田间药效试验结果显示,在相同施药量5g·666.7 m-2处理下,Bt微胶囊剂药后3、5、7 d的校正防效均高于Bt原粉;Bt原粉的防效在药后5 d开始下降,而Bt微胶囊剂的残效期可达1周以上.     

苏云金杆菌与农药混配及杀虫效果的初步研究

在用5种农药的不同浓度处理后的马铃薯 蛋白胨 葡萄糖 琼脂(PPDA)培养基上培养苏云金杆菌Bacillus thuringiensis，结果表明在农药释稀5000倍时，对苏云金杆菌的生长没有影响。而苏云金杆菌与5种农药按1：1和3：1比例混配后的杀虫效果试验表明，苏云金杆菌苗体浓度为10 12个-L-1与绿植(稀释浓度5000倍)或虫满杀星(稀释浓度5000倍)的混配杀虫效果最好。表2参5