二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

朱顶红SRAP-PCR反应体系的建立和优化

本研究采用L_(16)(4~5)正交试验设计方法,对朱顶红SRAP-PCR反应体系中的5种因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,引物浓度,DNA模板量和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,结果表明各因素对朱顶红SRAP-PCR扩增反应影响大小依次为:d NTPs浓度引物浓度Mg~(2+)浓度DNA模板量Taq DNA聚合酶用量。优化获得的朱顶红最佳SRAP-PCR反应体系为:1×PCR Buffer、Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.25μmol/L、20μL体系中DNA模板量80 ng以及Taq DNA聚合酶用量0.5 U。用10个朱顶红品种基因组DNA对所得最优体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,能够为朱顶红遗传多样性研究和遗传图谱构建等提供重要技术支持。     

凤仙花属植物SSR-PCR反应体系的建立与优化

SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

杜鹃花SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验以马银花(R.ovatum)DNA为模板,采用L16(45)正交试验对目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系中5因素(Taq聚合酶用量,Mg~(2+)浓度,模板DNA用量,dNTPs浓度,引物浓度)进行了优化,建立了杜鹃花植物SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,模板DNA 1.00 ng/μL,Mg~(2+)为3.00 mmol/L,dNTPs为0.25 mmol/L,引物为0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶为2.00 U。比较了各因素对反应体系的影响,发现引物物浓度的差异对体系影响显著,各因素影响的先后顺序为引物Taq DNA聚合酶dNTPsMg~(2+)模板DNA。并运用了杜鹃属的4个不同种对最优体系进行了稳定性验证,选择了10个通用性的引物进行筛选,发现10个引物均能扩增出条带,其中有6个引物能够得到清晰可辨、多态性丰富的条带。该体系的建立将为杜鹃花遗传多样性、差异基因的表达分析,分子辅助育种、遗传图谱构建等研究提供技术支持。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

丝瓜SRAP反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L_(16)(4~5)正交试验设计。通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg~(2+)、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、Mg~(2+)和模板DNA浓度分别为1 U/20μL、0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.25 mmol/L和75 ng/20μL。扩增实验结果表明,该反应体系稳定性较好,可重复性高,具有较好的分辨率。可从59对引物中筛选出14对适用于元宝枫并具有较明显的多态性的SSR引物,为进一步研究元宝枫的分子标记辅助育种、SSR遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了良好的基础。     

凤仙花ISSR-PCR体系建立与优化

建立最适的PCR反应体系是成功进行ISSR-PCR的关键,且反应的扩增效果易受多种因素的影响,本研究采用正交试验和单因素筛选试验两种方法,选用凤仙花叶片DNA为实验材料,针对影响凤仙花ISSR-PCR反应较大的 Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA这5个因素进行优化并筛选,最终建立凤仙花ISSR-PCR最佳反应体系:25μL PCR反应体积中, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、引物浓度为0.4μmol/L、模板DNA浓度为150 ng、dNTPs浓度为0.15 mmol/L、Taq酶为0.5 U。利用该体系筛选出14条可用于凤仙花ISSR-PCR扩增的引物。通过建立凤仙花属最佳ISSR-PCR反应体系,为研究凤仙花属植物提供分子标记水平上的理论依据和技术方法。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

仁用杏ISSR分析体系的正交优化

本研究以仁用杏丰仁为试材,采用经改良的CTAB法提取实验材料幼叶基因组DNA.利用正交设计法,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq/DNA聚合酶及模板DNA用最5种因素4水平出发,构建和优化仁用杏ISSR-PCR反应体系,并采用直观分析和方差分析相结合的方法分析正交实验结果,最终建立了仁用杏ISSR-PCR最佳反应体系总体积20μL:1.5 U Taw DNA聚合酶、2.0 mmol/L MgCl_2、0.15 mmol/L dNTPs、0.35μmol/L引物、30～60 ng模板DNA.在优化体系的基础上筛选出 13个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定每个引物的最适退火温度.经对最佳反应体系和程序进行了验证,结果显示该体系具有扩增稳定性.     

芝麻SSR检测体系的优化与应用

为了建立一套适用于芝麻SSR标记检测的技术体系,以5个芝麻新品种为试验材料,选用35对SSR引物,从反应体系、反应程序、电泳、银染4个环节进行优化。结果表明：反应总体积为10 μL,优化后的基本成分及用量分别为25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL,10 mmol/L dNTPs 0.3 μL,5 U/μL Taq酶0.3 μL,50 ng/μL Primer 0.9 μL,10×Buffer 0.7 μL,25 ng/μL DNA模板2.5 μL,ddH2O 4.1 μL。反应程序为：94℃ 3 min;94℃ 1 min,60℃ 30 s,72℃ 45 s,10个循环;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 45 s,30个循环;72℃ 5 min。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银快速染色检测效果良好。筛选出多态性较强的SSR引物24对,用这些引物对20个品种进行扩增,初步分析了SSR标记应用于芝麻DNA指纹分析的潜力。     

新麦草种质遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR标记对15份新麦草(Psathyrostachys juncea)种质资源进行遗传多样性检测.为获得稳定的新麦草ISSR反应体系,对反应条件中的dNTP、Taq酶浓度、引物浓度、Mg_(2+)浓度等因子进行了优化,建立起的最佳反应体系为:25 μL的反应体系中含有dNTP 2.5 μL、Taq酶0.2 μL、Primers 1 μL、Mg~(2+)1.5 μL、2.5 μL 10×Buffer、2 μL模板DNA和ddH2O 15.3 μL.ISSR标记结果显示,筛选出的重复性好、谱带清晰的ISSR引物8条,共获得84个扩增位点,其中多态性位点72个,多态性比率(PPB)为85.7%.通过遗传相似系数(GS)的计算,供试种质材料间的GS值在0.440 5～0.904 8之间,表现出丰富的遗传多样性.通过聚类分析,将15份新麦草种质材料划分为四大类,且呈现出一定的地域性分布规律.     

葡萄5BB品种SRAP-PCR反应体系影响因素

为建立适合葡萄5BB品种的SRAP-PCR反应体系,利用正交设计对葡萄SRAP-PCR反应体系5种因素(Taq DNA聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)4个水平进行优化。结果表明,各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小顺序为:Mg2+,引物,dNTP,Taq DNA聚合酶,模板DNA;筛选出各因素的最佳水平,建立了葡萄5BB品种SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶2U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA60ng,dNTP0.25mmol/L,引物0.10μmol/L。这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对葡萄进行相关研究提供了帮助。     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。     

杨梅SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜杨梅基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系。以杨梅基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、模板DNA、dNTPs、Tap DNA聚合酶和引物5种因素4个水平对杨梅SRAP-PCR反应体系进行优化。各因素对杨梅SRAP-PCR反应的影响程度从大到小依次为：Mg2+,模板DNA,dNTP,引物和Taq DNA聚合酶;建立的杨梅SRAP-PCR最佳反应体系为25μL反应体系中含2.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模板、0.25 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和1.5 U Taq DNA聚合酶。这一体系的建立为今后利用SRAP-PCR技术开展杨梅分子遗传学研究打下了基础。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L16(45)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化.结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-P...     

丝瓜SRAP-PCR体系建立与优化

本文以丝瓜(Luffa cylindrica (L.) M. Roem)基因组DNA为模板,采用正交试验设计,对SRAP (sequence related amplified polymorphism, 序列相关扩增多态性)反应体系中的4种关键因素（dNTPs、Taq酶、引物、模板）进行优化,建立了适合于丝瓜基因组SRAP分子标记的扩增体系：反应总体积10μl,其中含Taq酶1.0 U、模板DNA 50.00 ng、dNTPs 0.3mmol/L、引物0.30μmol/L。该体系能很好地满足丝瓜基因组SRAP标记的要求,可应用于丝瓜的分子生物学研究。