Hippo通路及Wwtr1基因的研究进展

Hippo信号通路是在果蝇中发现的,能够调控器官大小,其功能异常会导致肿瘤发生。对Hippo通路及其上游调控因子进行了综述,并对其与其他信号途径之间的关联也进行了介绍。最后,重点阐述了Wwtr1基因的一些生物学功能和研究进展。     

外源褪黑素诱导下Hippo信号通路调控山羊绒生长mRNA和lncRNA的生物信息学分析

为分析绒山羊皮肤中受Hippo信号通路调控的绒生长候选基因集,本研究选取6只罕山白绒山羊随机分为对照组和褪黑素处理组,每组设3个重复。以自然年为试验周期,每月采集皮肤样本进行RNA测序,使用Bowtie、TopHat、Cufflinks、Cuffmerge、Cuffdiff、Cuffcompare、CPAT和CPC软件分析DE-mRNA和DE-lncRNA,联合PCA分析它们对次级毛囊生长周期的应答,利用WGCNA挖掘调控山羊绒生长的基因模块,GSEA分析候选基因集的生物学功能。结果表明：1)筛选得到组间DE-mRNA 2 024个和DE-lncRNA 329个,它们应答了绒山羊皮肤次级毛囊的生长周期。2)获得有生物学意义的对照组7个和试验组9个基因模块。3)深入分析富集到平衡哺乳动物皮肤生长分化、毛囊形态发生的Hippo信号通路基因模块,揭示了外源褪黑素诱导下调控山羊绒生长候选基因集191个mRNA和49个lncRNA的共表达调控网络关系。4)发现候选基因集与皮肤发育生物学过程(|NES|>1且FDR<25%)、Hippo信号通路(|NES|>1且FDR<25...     

β-catenin在藏山羊切牙牙胚发育过程中的表达

研究β-catenin在藏山羊牙胚发育过程中的表达与分布变化,并探讨其在牙齿发育过程中的作用机制。制备藏山羊切牙各期标本,并采用免疫组化方法观察。结果表明,帽状期在星网层、内釉上皮、牙囊均为细胞核阳性表达;钟状早期在内釉上皮、牙乳头细胞核阳性表达;钟状晚期在颈环、牙尖细胞膜阳性表达;成釉期早期在成釉质细胞、成牙本质细胞阳性表达;成釉期晚期均阴性表达。β-catenin在早期牙胚发育中有特定的时空表达模式,通过参与Wnt信号通路和作为黏附分子两种方式,对确定牙胚的形态发生重要作用。     

Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway

The Wnt-Wingless (Wg) pathway is one of a core set of evolutionarily conserved signaling pathways that regulates many aspects of metazoan development. Aberrant Wnt signaling has been linked to human disease. In the present study, we used a genomewide RNA interference (RNAi) screen in Drosophila cells to screen for regulators of the Wnt pathway. We identified 238 potential regulators, which include known pathway components, genes with functions not previously linked to this pathway, and genes with no previously assigned functions. Reciprocal-Best-Blast analyses reveal that 50% of the genes identified in the screen have human orthologs, of which approximately 18% are associated with human disease. Functional assays of selected genes from the cell-based screen in Drosophila, mammalian cells, and zebrafish embryos demonstrated that these genes have evolutionarily conserved functions in Wnt signaling. High-throughput RNAi screens in cultured cells, followed by functional analyses in model organisms, prove to be a rapid means of identifying regulators of signaling pathways implicated in development and disease.     

Comment on "Activation of β-catenin in dendritic cells regulates immunity versus tolerance in the intestine"

Manicassamy et al. (Reports, 13 August 2010, p. 849) deleted β-catenin in intestinal immune cells using a CD11c-driven Cre recombinase, which decreased anti-inflammatory mediators and increased inflammatory bowel disease. However, the deletion of β-catenin in macrophages remains a caveat to their interpretation that Wnt signaling programs dendritic cells into a tolerogenic state. Development of strains expressing Cre in a more finely lineage-restricted pattern may help resolve this issue.     

意大利蜜蜂Hippo信号通路相关基因及其全长转录本的鉴定与分析

采用Blast工具将已鉴定到的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)全长转录本比对Nr数据库，共鉴定到意蜂Hippo信号通路中相关的49个基因及其550条全长转录本。运用Gffcompare软件将鉴定到的Hippo信号通路相关全长转录本与西方蜜蜂参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较，分别延长西方蜜蜂参考基因组注释到Hippo信号通路的9个基因的5'' UTR和7个基因的3'' UTR。通过Astalavista软件鉴定到Hippo信号通路相关的4个基因的7次可变剪切(AS)事件，包括2次外显子跳跃、2次内含子保留和3次可变5''端剪接。通过PCR验证了1个基因的AS事件真实性。利用TAPIS pipeline鉴定到意蜂Hippo信号通路相关的24个基因含有1个及以上可变多聚腺苷酸化(APA)位点，其中含有1个APA位点的基因数量最多。通过TBtool软件鉴定APA位点上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。     

A polarized epithelium organized by beta- and alpha-catenin predates cadherin and metazoan origins

A fundamental characteristic of metazoans is the formation of a simple, polarized epithelium. In higher animals, the structural integrity and functional polarization of simple epithelia require a cell-cell adhesion complex that contains a classical cadherin, the Wnt-signaling protein β-catenin and the actin-binding protein α-catenin. We show that the non-metazoan Dictyostelium discoideum forms a polarized epithelium that is essential for multicellular development. Although D. discoideum lacks a cadherin homolog, we identify an α-catenin ortholog that binds a β-catenin-related protein. Both proteins are essential for formation of the epithelium, polarized protein secretion, and proper multicellular morphogenesis. Thus, the organizational principles of metazoan multicellularity may be more ancient than previously recognized, and the role of the catenins in cell polarity predates the evolution of Wnt signaling and classical cadherins.     

Wnt/β-catenin信号途径与早期内胚层及相关器官的发育

介绍早期胚胎发育中Wnt/β-catenin信号途径对早期内胚层以及肝脏、胰腺、肠等内胚层器官发育的影响和相关的分子机制。     

山羊早期胎儿组织TET1与Wnt通路基因的表达变化及其相关性

【目的】通过检测TET1和Wnt信号通路相关基因以及DKK家族基因在山羊胎儿发育早期的表达变化,分析TET1与Wnt通路基因的相关性,为TET1调控山羊胎儿发育研究提供理论依据。【方法】选取12只健康大足黑山羊母羊,自然发情后与同一只种公羊自然交配。采用剖腹产手术的方法,分别获得妊娠20、25、30、60和90d的胎儿,对胎儿的生长指标(体重、体长)进行统计,并采集了60和90d胎儿的组织器官样品(心、肝、肺、肾、脑、皮肤),通过Real-time PCR(RT-PCR)检测各样品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相对表达量。利用SPSS软件分析山羊胎儿发育早期不同阶段TET1与WNT信号通路相关基因相关性以及基因表达显著性(P0.05)。【结果】山羊妊娠早期胎儿生长在60d后有显著变化。荧光定量检测结果表明,TET1基因表达随妊娠天数的增加呈上升趋势。Wnt家族基因在山羊胎儿发育中都检测到表达(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表达量随胎儿发育逐渐增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d时有显著高表达(P0.05);Wnt4在胎儿发育20 d时表达显著(P0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有显著高表达(P0.05)。DKK家族基因表达检测结果显示,DKK1在胎儿发育早期阶段都有表达,DKK2/3在妊娠初期表达量较低,后期表达增高。通过组织中基因表达检测显示,TET1在90d胎儿肝、肺、肾和脑中的表达水平相比于60d胎儿组织升高,肝中表达量显著(P0.05)。Wnt家族基因Wnt2在组织器官中有相对活跃的表达,妊娠90d胎儿肺中表达量极显著(P0.01);Wnt16基因在胎儿皮肤组织中表达显著(P0.05),且维持在一个较高的水平;Wnt5a和Wnt7b在肾中表达显著(P0.05),其他Wnt基因在组织中都有表达。相关性分析显示,胎儿生长指标(体重、体长)变化与TET1的表达呈极显著正相关(P0.01);TET1在胎儿发育早期的表达与Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈现正相关,与Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈负相关,其中与Wnt5b呈显著负相关(P0.05),与Wnt7b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt通路基因之间也有相互关系,Wnt2与Wnt4呈极显著负相关(P0.01)。Wnt2与Wnt7b,Wnt2b与Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a与Wnt5b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt4与Wnt5a呈显著正相关(P0.05)。【结论】获得了TET1与Wnt基因在山羊胎儿发育早期的表达模式,并进行了相关性分析,填补了这些基因在山羊方面的研究空白;TET1与Wnt基因对山羊胎儿早期的发育和组织的形成是一个动态的调控变化过程;TET1基因表达与部分Wnt基因呈现显著正相关,部分呈现显著负相关;Wnt通路基因之间表达量呈现一定的相关性。这些数据为TET1与Wnt分子调控山羊早期胎儿发育的机制深入研究提供了参考。     

Wnt3a-mediated formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates LRP6 phosphorylation

The canonical Wnt-beta-catenin signaling pathway is initiated by inducing phosphorylation of one of the Wnt receptors, low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6), at threonine residue 1479 (Thr1479) and serine residue 1490 (Ser1490). By screening a human kinase small interfering RNA library, we identified phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha and phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase type I (PIP5KI) as required for Wnt3a-induced LRP6 phosphorylation at Ser1490 in mammalian cells and confirmed that these kinases are important for Wnt signaling in Xenopus embryos. Wnt3a stimulates the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphates [PtdIns (4,5)P2] through frizzled and dishevelled, the latter of which directly interacted with and activated PIP5KI. In turn, PtdIns (4,5)P2 regulated phosphorylation of LRP6 at Thr1479 and Ser1490. Therefore, our study reveals a signaling mechanism for Wnt to regulate LRP6 phosphorylation.     

A -defensin mutation causes black coat color in domestic dogs

Genetic analysis of mammalian color variation has provided fundamental insight into human biology and disease. In most vertebrates, two key genes, Agouti and Melanocortin 1 receptor (Mc1r), encode a ligand-receptor system that controls pigment type-switching, but in domestic dogs, a third gene is implicated, the K locus, whose genetic characteristics predict a previously unrecognized component of the melanocortin pathway. We identify the K locus as beta-defensin 103 (CBD103) and show that its protein product binds with high affinity to the Mc1r and has a simple and strong effect on pigment type-switching in domestic dogs and transgenic mice. These results expand the functional role of beta-defensins, a protein family previously implicated in innate immunity, and identify an additional class of ligands for signaling through melanocortin receptors.     

家蚕BmYki-1基因鉴定与表达特征

【目的】Hippo信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Yki来调控下游基因的表达,在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,对其Hippo通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕BmYki-1并对其序列信息和表达特征进行分析,为进一步研究中肠中Hippo信号通路提供基础,更好地了解Hippo信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用NCBI数据库及家蚕基因组数据库等相关信息,以哺乳动物和果蝇的Yki蛋白序列为依据,对家蚕Yki基因的同源序列进行鉴定;以家蚕大造品系为研究材料,利用PCR和cDNA末端快速克隆技术克隆获得家蚕BmYki两种可变剪切体的全长序列BmYki-1和BmYki-2,并基于生物信息学方法对两种剪切体的基因序列特征及蛋白结构特征进行分析;重点对BmYki-1在家蚕中肠组织中的功能进行探索;利用半定量PCR检测家蚕L5D3不同组织及中肠各个龄期BmYki-1表达情况;构建BmYki-1过表达载体并转染家蚕胚胎细胞系对其进行亚细胞定位分析;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达情况。【结果】家蚕中存在两种可变剪切形式的BmYki,分别为BmYki-1和BmYki-2,在家蚕基因组数据库中对应的注释号分别为BGIBMGA0082-TA和BGIBMGA0081-TA,其开放阅读框(ORF)分别为1 329和1 227 bp,分别编码442和408个氨基酸,其蛋白质分子量分别为48和44.1 kD,等电点分别为5.18和5.50,在139-171、220-252氨基酸处均各有1个WW结构域。多物种进化树表明,家蚕BmYki-1与同为鳞翅目的昆虫脐橙螟的亲缘关系最近,与鞘翅目、膜翅目昆虫较近,与双翅目昆虫较远,而与脊椎动物的亲缘关系最远。结果显示BmYki-1在家蚕中肠和丝腺中特异表达,中肠不同龄期表达谱分析结构显示表达量从2眠开始上调,在5龄的前中期表达水平较高。亚细胞定位试验表明BmYki-1蛋白在家蚕胚胎细胞系中主要存在于细胞核中,但在细胞质中也有分布。与对照相比,用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达量显著上调。【结论】获得了BmYki-1全长序列及时空表达特征,亚细胞定位BmYki-1蛋白主要在细胞核中,推测其在家蚕中肠细胞生长发育及损伤修复中起重要作用。     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的 差异表达microRNA及其调控网络

【目的】 微小RNA（microRNA,miRNA）是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道（AmCK和AmT）进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对;将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|log₂ fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder 软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路（pathway）富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR（Stem-loop RT-PCR）和荧光定量PCR（qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】 AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段（raw reads）,经严格过滤后得到的有效读段（clean reads）数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】 对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。