表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因对猪的DNA免疫

【目的】检测PRRSV GP5 DNA重组质粒在猪体诱导的免疫反应以及细胞因子的佐剂效应。【方法】将表达PRRSV GP5的DNA重组质粒与表达3种细胞因子的重组质粒联合免疫SPF猪，经3次免疫后人工感染PRRSV，检测体液免疫、细胞免疫以及攻毒保护性反应。【结果】重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生中和抗体，效价达1:19.2，并可诱导机体产生较强的细胞免疫，攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降39%，表明表达PRRSV GP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-4与pCI-GP5共免可将中和抗体效价提高到1:35.5，且可增强细胞免疫反应，与对照组相比，病毒血症的出现频率减少17%，PRRSV阳性组织检出率下降64%；pcDNA-IL-2与pCI-GP5共免也可增强猪的细胞免疫，与对照组相比，病毒血症的出现频率下降50%，PRRSV阳性组织检出率减少59%； pcDNA-IFN- 与pCI-GP5共免对病毒血症的出现及病毒在组织中的分布均没有抑制作用。【结论】动物试验结果表明IL-4及IL-2可作为PRRSV GP5 DNA重组质粒的免疫佐剂。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。     

陕西及周边地区PRRSV Nsp2与GP5基因变异分析

【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2和GP5的变异情况。【方法】采用套式RT-PCR方法,从肝、脾、肺和血清中直接扩增Nsp2、GP5基因并克隆测序,将获得的PRRSV流行毒株序列与GenBank中30个PRRSV参考毒株进行比对分析,构建进化树。【结果】获得了13株PRRSV的Nsp2基因序列(GenBank登录号KM233849~KM233861)和12株GP5基因序列(GenBank登录号KM233862~KM233873)。基因进化树分析显示所有测定PRRSV流行毒株均属北美洲型。对Nsp2基因序列分析发现,12株PRRSV为氨基酸缺失毒株,1株PRRSV为经典毒株。发现GSXF毒株有可能是一株重组毒株。PRRSV变异株与经典株相比,GP5蛋白中存在多处氨基酸点突变。【结论】陕西猪场PRRSV流行毒株以变异株为主,同时存在经典毒株和重组毒株。     

通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构

 【目的】口蹄疫病毒（FMDV）对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual 中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf 9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒Bac mP12A3C和Bac P12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25～30 nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。     

禽流感病毒M2e基因与鸡IgG Fc基因在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒中,构建酵母表达载体。将阳性质粒线性化后电转化入感受态毕赤酵母X-33中,再经甲醇诱导后,通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定融合蛋白。之后用其免疫非免疫鸡,检验其免疫原性。【结果】成功构建了表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-M2-Fc,并通过Zeocin筛选及PCR鉴定出了阳性重组子;阳性重组子经甲醇诱导后得到融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定证实,融合蛋白得到正确表达,并且可以与M2e阳性血清反应。动物免疫试验证实,该融合蛋白可以诱导鸡产生抗M2e抗体,具有良好的免疫原性。【结论】融合蛋白M2e-Fc在巴斯德毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,该融合蛋白具有较好的免疫原性,为后期进行其他免疫试验奠定了基础。     

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的差异蛋白

【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-145细胞感染PRRSV后,热休克蛋白70和S100钙结合蛋白A6表现为下调,而硫氧还蛋白、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白表现为上调。功能预测分析发现,5个蛋白与MARC-145细胞抗应激、抗氧化、生长、凋亡和信号转导等作用息息相关。【结论】高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后,能诱导细胞部分功能蛋白表达量的增加或减少。     

种籽和花粉传播植物病毒状况及存在问题

本文综述了国内外有关种籽和花粉传播植物病毒的重要资料,指出种籽传播病毒的特征．目前已知的在分类上属于２３群的１０８种和未归类的９种种传植物病毒中,我国已见报道的有１７种,花粉传播的植物病毒共１０种,其中９种分属于３个分类群,另有１种尚未归类．对存在的问题提出了讨论．这些问题包括多种过去被误认为是种传的病毒、同物异名的种传病毒、隐性病毒、未经证实的种传病专以及通过花粉和种籽传播的“类病毒草”等．     

计算机病毒的预防和杀毒策略

针时计算机病毒的种类,常见的传播方式,命名规则以及命名解释进行了介绍,并根据其传播方式,介绍了相应的防毒措施和有效的顽固性病毒杀毒策略。按照所介绍的知识,能够防止绝大部分病毒时网络计算机的入侵,并能够在杀毒软件无效的情况下,对顽固性病毒进行彻底地查杀。     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

广州市郊及其邻近地区辣椒CMV和TMV的鉴定

根据对广州市郊及其邻近地区辣椒病毒病的田间调查、寄主范围和症状特点、血清学反应以及RT-PCR的试验结果，证实了黄瓜花叶病毒(CMV)是广州市郊及其邻近地区辣椒病毒病的主要毒原之一；通过生物学和血清学方法，鉴定了烟草花叶病毒(TMV)是另一主要毒原。在采集的病样中，根据鉴别在寄主上的症状特点，主要存在两种类型的分离物，分别称为分离物Ⅰ和分离物Ⅱ。分离物Ⅰ在辣椒、西葫芦、三生烟、普通烟、心叶烟、曼陀罗等寄主植物上引起花叶等症状，在苋色藜、昆诺阿藜上产生局部枯斑，不侵染千日红，由此可初步鉴定为CMV；从间接ELISA和RT—PCR的检测结果也可判断分离物Ⅰ是CMV，其检出率为36．67％。分离物Ⅱ在辣椒、普通烟上产生花叶症状，在心叶烟、曼陀罗、千日红、三生烟、苋色藜和昆诺阿藜等寄主植物上产生局部枯斑，而不侵染西葫芦，由此可初步鉴定其为TMV；间接ELISA检测结果表明，分离物Ⅱ是TMV，其检出率为43．33％。另外，TMV在田间发生率明显高于CMV。     

陕西辣椒病毒病的毒原鉴定及化学防治药剂筛选

分别从陕西咸阳、兴平、杨凌、柔谷、眉县、岐山、凤翔等地采集辣椒病毒病标样126份,在室内通过单斑分离及回接验证得到5种分离物,采用鉴别寄主的生物学反应和DA S-EL ISA法鉴定,结果表明,引起陕西辣椒病毒病的毒原有黄瓜花叶病毒(CM V)、烟草花叶病毒(TM V)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和蚕豆萎蔫病毒(BBW V),其中CM V和TM V是优势毒原种群,分别占检测样品的60.31%和30.94%。在室内分别以CM V和TM V的枯斑寄主苋色藜和心叶烟为测试寄主,采用半叶法对接种叶片分别于接种前和接种后涂施病毒抑制剂,测试了7种病毒抑制剂的抑制效果。结果表明,接种前后涂施3.85%病毒必克水乳剂500倍液,均对黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒有很好的防治效果,且接种前涂施的防治效果较接种后涂施的防治效果好。     

香蕉条斑病毒及其所致病害研究进展

香蕉条斑病毒病是香蕉的主要病毒病害,可造成7%～90%的产量损失;在某些地区,香蕉条斑病毒病已成为制约香蕉产业发展的主要因素之一。本文较全面地介绍了香蕉条斑病毒的生物学特性、理化特性、病株中的BSV检测方法及病害的防治措施,以期让读者较全面地了解香蕉条斑病毒病,使其在生产上的损失降低到最低水平。     

母源抗体对禽网状内皮增生病病毒感染诱发生长迟缓和免疫抑制的预防作用

【目的】确定经禽网状内皮增生病病毒（REV）细胞适应毒免疫的种鸡提供的母源抗体在雏鸡抗REV感染中的保护性免疫作用。【方法】分别对有母源抗体和无母源抗体的雏鸡人工感染REV野毒，比较它们的生长速度和对新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒(AIV)灭活苗免疫后的抗体反应。【结果】在没有REV母源抗体的商品代肉鸡，1日龄感染REV不仅造成生长迟缓，还会显著抑制对NDV和AIV (H5和H9）疫苗的免疫反应。由致弱的REV疫苗免疫的父母代种鸡提供的母源抗体，不仅可预防REV野毒感染引起的生长迟缓，也可预防REV引起的对NDV和AIV灭活疫苗免疫反应的抑制作用。在1日龄攻毒REV后，有REV母源抗体组对所有三种灭活疫苗免疫后的抗体水平都显著高于无母源抗体组。免疫后4周，有母源抗体组和无母源抗体组对NDV、AIV-H9和AIV-H5的血凝抑制（HI）抗体滴度分别是3.36±2.04 vs 1.58±1.69(P＜0.01)，6.27±3.87 vs 0.71±1.60(P＜0.01)和6.72±3.92 vs 0.54±1.44(P＜0.01)。【结论】来自免疫种鸡的REV母源抗体不仅有效地预防雏鸡感染REV，而且有效地预防或减弱REV感染造成的生长迟缓及其对NDV和AIV灭活疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。     

PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响

 以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。     

甘蔗杂交种子传播甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的检测

[目的]探究甘蔗杂交种子对甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的传播性,为甘蔗抗病育种提供参考.[方法]采集父本或母本感染花叶病或黄叶病的甘蔗杂交种子样品10份,分别以SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物进行一步法RT-PCR扩增、克隆和测序分析.对田间实生苗进行生物学观察,并采用RT-PCR检测其叶片SCMV、SrMV和SCYLV携带性.[结果]经特异性引物检测,10份杂交种子中仅有样品H4显示SrMV阳性,扩增的特异片段大小为828 bp,其核苷酸序列与GenBank中已报道的SrMV基因序列同源性达99％.聚类分析结果表明,样品H4的SrMV和GenBank中SrMV外壳蛋白序列的自举水平达100％,证实H4样本感染的病毒为SrMV.田间连续45 d观察均未发现出现病毒症的甘蔗幼苗;经RT-PCR检测,均未在10个样品实生苗叶片中发现此3种病毒.[结论]甘蔗种子可携带高粱花叶病(SrMV),但未能通过种子传播至实生苗.     

延庆地区侵染百合的病毒检测与序列分析

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。