重组α-银环蛇毒素融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化(英文)

[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。     

重组融合蛋白最佳诱导表达条件的研究

[目的]对重组融合蛋白的最佳诱导表达条件进行研究。[方法]为提高IMPACT-CN系统的pTYB11载体重组融合蛋白的表达量,针对其表达所需适宜的诱导时机、诱导剂量、诱导时间、诱导温度、氨苄青霉素浓度、摇瓶装液量等培养条件,采用不同技术指标进行了平行发酵试验。[结果]表达产物的SDS-PAGE及Western-Blotting分析表明重组融合蛋白具有良好免疫原性。[结论]为以后的蛋白纯化诊断、用蛋白质生产诊断试剂盒及其临床应用奠定了基础。     

鸭MHCⅡα融合蛋白表达条件的优化

构建了鸭MHCⅡα的融合表达载体PET-28a,对融合蛋白在大肠杆菌中表达量的影响因素进行了研究.SDS-PAGE分析表明,诱导温度22℃,时间3 h,IPTG浓度0.05 mmol/L,OD600m值0.45,通气量90%和pH 7.2时MHCⅡα融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的23.4%,比优化前提高了16.7%.蛋白经纯化后纯度可达90%.Western blot分析表明,该蛋白可被鼠抗鸭MHCⅡα阳性血清识别,具有较好的免疫学活性.     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-AP酶融合蛋白表达条件优化

为提高抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。采用液体培养基发酵培养能表达出目的蛋白的基因工程菌,对诱导表达得到的目标融合蛋白进行鉴定,探讨5种培养基、6种诱导时间和4种诱导剂-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度对融合蛋白表达的影响,再通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基琼脂糖凝胶柱和直接竞争酶联免疫分析法进行纯化并对其活性进行鉴定。结果表明,最适宜条件为SB培养基,诱导剂IPTG浓度为0.6 mmol/L,培养9 h,该条件下抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-AP融合蛋白的表达效果较好,表达量从2.89%增加到5.75%,总体增加了约2.86百分点,通过NHS活化羧基琼脂糖凝胶柱纯化后融合蛋白的浓度为1.973 mg/mL,IC₅₀值为56.923 1 ng/mL。本试验单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量得到了很好的提高,并获得生物活性较好的融合蛋白,为后续呋喃唑酮代谢物免疫检测分析方法的建立奠定了一定基础。     

新型Resilin-R5融合蛋白的大肠杆菌表达和纯化

为了获得兼具高弹性和硅沉积性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究其在大肠杆菌中的表达,建立了简易的纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120 mg·L-1发酵液,为高弹性-硅沉积融合蛋白Resilin-R5的性能表征和创新应用奠定了基础。     

鲤鱼重组IL–17N的原核表达条件优化及蛋白纯化

为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。     

重组酪醇糖基转移酶表达条件的优化与纯化

[目的]研究利用现代生物技术制备红景天苷的方法。[方法]试验借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。[结果]最佳诱导表达条件为：诱导时间5 h,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导温度37℃;用镍柱亲和层析对该含有组氨酸标签的融合蛋白进行纯化,获得了纯度达99%以上的目的蛋白。[结论]该项研究为重组糖基转移酶的纯化提供了成功的经验。     

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACT...     

鸡毒霉形体黏附素截短蛋白表达条件的优化

研究了培养温度、培养时间、培养基pH值以及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galacto-side,IPTG)浓度等不同条件对鸡毒霉形体黏附素截短蛋白在大肠杆菌中表达量的影响。经SDS-PAGE分析表明:诱导温度为28℃、诱导时间为9 h、培养基pH值为7.0、IPTG浓度为0.010 mmol/L时目的蛋白在细菌裂解沉淀和上清液中均最大量表达,分别达到30%和17%左右。上清液经GST.Bind Resin亲和层析分离纯化后,洗脱产物中pMGAⅣ融合蛋白纯度高达95%。Western-blot分析表明,该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别,具有较好的免疫学活性。     

莱茵衣藻缺铁应答调控基因femu2p-C2H2的融合表达与纯化

为获得目标蛋白以用于蛋白功能解析,本研究将锌指蛋白C2H2以GST(Glutathione S-transferase)融合蛋白的形式进行了表达,并确定了表达的最佳条件:37℃、IPTG诱导4 h、IPTG终浓度为1.0 mmol/L。利用固定化的还原型谷胱甘肽(GSH)对GST-C2H2融合蛋白进行一步亲和纯化,获得目标融合蛋白,25倍超滤浓缩之后测定其浓度为1.762 mg/mL。     

猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

基因工程根瘤菌表达融合蛋白GST-HAL1条件的优化及耐盐水平的提高

利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒载体pGEX-HAL1，三亲本杂交转化根瘤菌，表达融合蛋白GST-HAL1。结果表明，与空白菌和未诱导工程根瘤菌相比，诱导后工程根瘤菌的耐盐水平有明显提高。通过检测不同温度、不同诱导时间和不同IPTG诱导浓度条件下融合蛋白的表达量，优化各个参数。在28℃的温度条件下，融合蛋白GST-HAL1表达量量明显增加；在IPTG浓度为1．0mmol·L^-1，诱导时间为3h的条件下，融合蛋白的表达量最高，培养基产生的融合蛋白为3．02mg·L^-1，占可溶性蛋白质的39．34％。本研究对今后利用基因工程技术研制新型生物肥料做了有益的尝试。     

PRRSV新疆株N基因原核表达条件的优化及蛋白纯化

[目的]获得重组表达质粒pGEX-6P-N在大肠杆菌BL21中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度.[方法]通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Western blotting分析融合蛋白的免疫学活性.[结果]融合蛋白在37℃条件下,经终浓度为1.2 mmol/L的IPPG诱导表达4.5 h后获得了较高的表达水平.纯化后的融合蛋白经BCA法测定蛋白浓度达到0.587 mg/mL.Western blotting试验表明,GST-N蛋白能与抗PRRSV阳性血清发生特异性反应.[结论]为建立N特异性抗体的间接ELISA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础,为新疆PRRS的防控提供了理论支持.     

抗呋喃它酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的优化

[目的]优化基因工程菌的诱导表达条件,以提高抗呋喃它酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量.[方法]采用液体发酵法培养抗AMOZ衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的基因工程菌,分别研究不同宿主菌、培养基、初始pH、诱导时期、诱导时间和蛋白诱导表达剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-...     

Luman-N-端融合蛋白的表达、纯化及小鼠免疫效果评价

Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预计融合蛋白大小一致,融合蛋白经电洗脱纯化后免疫小鼠,间接ELISA显示抗体效价达到1∶4000,淋巴细胞增殖试验表明与空白组相比,Luman-N-端融合蛋白质量浓度为10、20、40和60μg/mL时,能显著刺激淋巴细胞的增殖(P<0.05);质量浓度为80、100μg/mL能极显著地刺激淋巴细胞的增殖(P<0.01)。     

植物的冷调节蛋白及诱导其基因表达的条件

人们发现植物在低温锻炼过程中产生的特异性蛋白——冷调节蛋白(cold regulated proteins，CORPs)与植物的抗寒力密切相关，冷调节基因是一些诱导型表达基因，它们除受低温诱导外，还能接受诸如外源ABA、水分胁迫等外界条件的诱导，在综述这些诱导冷调节基因表达条件的基础上，提出了在低温寒害来临之前有目的地诱导大田植物冷调节基因表达，合成冷调节蛋白，可提高植物抗寒力的新思路，这在农业生产以及园艺植物南树北移工作中具有重要的现实意义。     

产气荚膜梭菌β2 -β1毒素融合基因在大肠杆菌中高效表达条件的优化

本研究在已获得产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因表达载体,并在BL21（DE3）中成功表达的基础上,研究了以乳糖为诱导剂在不同条件下对β2-β1。重组蛋白诱导表达的影响,并对其表达条件进行了优化。结果表明,重组菌株BL21（DE3）（pXETB2B1）在37℃、菌体诱导密度OD_600为1．0、乳糖诱导浓度为0．1g／L时诱导5h,目的蛋白的表达效果最好,乳糖则以分批添加的方式为佳。