禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因PCA_（10）的高效表达及其免疫原性

以ＰｓｔＩ酶切含禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因片段ＰＣＡ１０的重组质粒ｒＰＣＡ１０，收集基因片段ＰＣＡ１０，经修饰后依次连接到系列高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ１～３的ＢａｍＨＩ切点上，转化至Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）中。经快速检测，这３种载体的重组子中均有ＰＣＡ１０插入。以间接ＥＬＩｓＡ检测重组子转化菌，只有ＰＥＶ—Ｖｒ１３载体的重组子转化菌与禽巴氏杆菌保护性荚膜抗原（ＰＣＡ）抗血清呈阳性反应，且ＯＤ值为原克隆菌株ｒＰＣＡ１０的３倍，初步证明ＰＣ１０已克隆至高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ３上，而且读码框架正确。用ＥＬＩｓＡ阳性表达克隆株ＰｃＡ７１—Ｖｒｆ３免疫小鼠和鸡，均达到７０％的保护率。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

脂质体-禽巴氏杆菌荚膜抗原的免疫研究

将禽巴氏杆菌荚膜粗提物经SephadexG—200分子筛凝胶过滤层析,获得纯化荚膜抗原;然后用反相蒸发法制备脂质体-荚膜抗原(A组),并以单纯荚膜抗原(B组)、禽霍乱“731”菌苗(C组)作对照,进行免疫试验,以酶标单克隆抗体间接ELISA,分别检测IgM和IgG的效价.结果,免疫后3个组的IgM效价相差都不显著(P>0.05),A组的IgG效价明显增高,与其他两组差异非常显著(P<0.01).3个组的IgM、IgG消长规律一致,IgM于免疫后7d开始上升,峰值在14d,其后下降迅速,第8周后降至免疫前水平,IgG于免疫后14d开始明显上升,峰值在28d,其后缓慢下降.保护率,A、B、C组分别为67％、33％、33％.结果表明,脂质体对禽巴氏杆菌荚膜抗原具有明显的佐剂作用.     

鹿源多杀巴氏杆菌荚膜分型及免疫原性

采用Carter荚膜群鉴定法净分离于我国鹿的38株多杀巴氏杆菌进行鉴定，结果显示：B型占68.4%（26/38）。A型占18.4%(7/38)，D型占5.3%(2/38)，3株未能确定型占7.9%(3/38)。并从26株荚膜B型巴氏杆菌中选出荧光典型的8株菌制备免疫原给健康兔注射，30d后用间接血凝法测定各株菌抗体效价，选出效价最高的2株菌D1PM和D2PM用小鼠增毒，当毒力稳定后用兔测得D1PM MLD为8个菌，D2PM MLD为17个菌，为疫苗的制造筛选出了优良的菌株。     

禽源多杀性巴氏杆菌(A:1)荚膜保护性抗原提纯及单克隆抗体细胞系建立

用Sep(?)adex G-200分之筛层析、DEAE-cellulose离子交换层析相结合,将禽源多杀性巴氏杆菌(A:1)荚膜抗原粗提物(CE)分为P1.P2两种成分,并经免疫保护试验证明,荚膜中含有保护性蛋白成份P1。P2分子量为129 100,且至少含有分子量分别为46700、42600和39800的3种蛋白亚基。用CE免疫BALB/c小鼠,建立了抗P1的单克隆抗体细胞系1B1和2B7,它们只与多杀性巴氏杆菌反应,而不与其他细菌交叉。     

鹿源多杀巴氏杆菌荚膜分型的研究

采用Ｃａｒｔｅｒ苹膜群鉴定法将分离于我国鹿的３８株多杀巴氏杆菌鉴定为三个苹膜型,其中Ｂ型占６８．４％,Ａ型占１８．４％,Ｄ型占５．３％,３株未能确定型,占７．９,证实荚膜Ｂ型是我国鹿多杀巴氏杆菌流行的主要血清群。     

猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达

利用已分离的菌株030224HB，根据NCBI上的序列(U52208)设计了一对引物，用PCR方法扩增了猪源多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白基因(ompH)，扩增的片段大小为1114bp(ORF为960bp)，并克隆到载体pMD18-T(T-Vector)，测序表明该基因相当保守。用pET-28b构建了原核表达载体pET28b-ompH，转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为35ku，与报道大小相近。Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物学活性，然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。     

多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C₁₆₈₄H₂₆₁₉N₄₅₇O₅₀₅S₃,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。     

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。     

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列（登录号：CP003313.1）设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a（+）-recN重组质粒并转化E.coliDH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点（pI）为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母（体内）中的半衰期>20 h,在大肠杆菌（体内）中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋（64.87%）及无规则卷曲（21.00%）为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。     

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C₁₀₈₅H₁₆₅₁N₂₉₃O₃₀₉S₉,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。     

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1）,使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物,选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段,并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增产物约为615 bp,编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高,而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现,ompW蛋白分子式为C₁₀₀₇H₁₅₆₇N₂₅₇O₂₈₃S₃,分子质量为21.90 ku,理论等电点（pI）为9.16,属碱性蛋白质,疏水指数为96.57,总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0）,属于疏水类蛋白;前21位氨基酸为信号肽,第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区,存在N-糖基化位点及磷酸化位点,不存在O-糖基化位点,具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位;二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%;三级结构是呈β-桶状的单聚体,隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。     

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达

皮肤坏死毒素（Dermonecrotic toxin，DNT）是产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida，T^＋Pm）的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T^＋Pm的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列，共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序，结果表明，toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99．8％以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游，转化BL21（DE3）大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得大小约173000的融合蛋白。Western blot结果表明，该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明，该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体，并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。     

8株禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）流行株外膜蛋白 H（OmpH）基因的变异情况,参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计1对特异性引物,采用PCR方法对不同来源的8株禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A、B、D）的OmpH基因进行扩增、测序。结果显示,11个菌株的OmpH基因开放阅读框在1002~1071 bp 之间;SignalIP 4.0预测结果表明,信号肽均为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在314~337 aa之间,推测的分子质量在33.76~37.04 ku之间。与GenBank中15个菌株OmpH基因序列比对结果发现,核苷酸同源性在84.9%~100.0%之间;氨基酸同源性在81.5%~100.0%之间;其中C48-1、1010、9003、890920、921012、XJ-e 6个国内禽Pm分离株OmpH序列同源性为100.0%。试验结果表明,国内禽Pm菌株OmpH基因非常保守。