山葡萄VaCBF1转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不同逆境胁迫(干旱、低温、盐胁迫)下的表达情况。【结果】成功地从山葡萄中克隆得到VaCBF1基因cDNA全长序列,其长度为762bp,编码253个氨基酸,在GenBank注册号为DQ517296。同源性分析证实,VaCBF1属于CBF转录因子家族。荧光定量PCR分析发现,低温胁迫可以诱导山葡萄VaCBF1基因高表达,而该基因的表达不受盐及干旱处理诱导。【结论】首次从山葡萄中克隆了VaCBF1基因,并证实该基因参与了植物对低温胁迫的应答。     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明CBF3基因已整合到黄瓜基因组中。     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF 3基因,将其与CaMV 35 S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35 S-CBF 3.通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株.经PCR检测鉴定,表明CBF 3基因已整合到黄瓜基因组中.     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

多毛番茄冷诱导转录因子CBF 1转化番茄的研究

番茄在气温低于12℃时即不能正常开花结实,因此番茄生产受到了很大限制。多毛番茄是一种野生番茄,具有耐低温甚至抗冻的特性,短暂遭受0℃的低温,仍能正常开花结实。构建了多毛番茄冷诱导转录因子CBF1的植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入番茄中,获得8株转基因阳性植株。转基因植株经冷诱导处理后,丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（O2－·）含量均低于非转基因对照,而超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、抗坏血酸过氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性则高于非转基因对照,表明转多毛番茄CBF1基因（ShCBF1）可以提高番茄的抗冷性。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

葡萄风信子转录因子MaMYB2的克隆及表达模式分析

试验从葡萄风信子"亚美尼亚"中利用RACE技术克隆了一个MYB类转录因子,命名为MaMYB2,Genebank登陆号为KJ744038。克隆到的MaMYB2全长711bp,开放阅读框为600bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白分子量约为22.34ku,理论等电点为5.46,保守域具有DNA结合位点;与矮牵牛(AAF66730.1)关系最近;核定位试验表明MaMYB2蛋白定位在细胞核中;实时定量PCR分析了MaMYB2在葡萄风信子"亚美尼亚"不同组织部位中的表达模式,结果不同组织中均有表达,在花中表达量最高,且随着花色变深表达量逐渐升高。结果表明,MaMYB2有可能参与了葡萄风信子中花青素积累的转录调控。     

山葡萄类黄酮-5-O-葡萄糖基转移酶基因(5GT)的克隆表达及遗传转化分析

为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定

DREB转录因子是一类可以调控多个与干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达的转录因子家族。从大豆耐盐品种铁丰8号中克隆了一个新的DREB基因GmDREB5。该基因编码309个氨基酸，具有典型的AP2／EREBP保守结构域，属于AP2／EREBP类转录因子中的DREB亚族。同源性比较分析表明，GmDREB5基因与Genbank登录的DREB基因同源性不高，属于新基因。酵母转录激活实验证明，该基因可以与DRE顺武作用元件特异结合，并具有转录激活活性；同时采用CaMV35S启动子驱动，构建了植物表达载体pBl35S-GmDREB5，并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中，再利用叶盘转化法将重组质粒导入烟草品种W38中。获得转基因烟草植株30株。     

山葡萄几丁质酶基因VCH3的克隆及植物表达载体的构建

利用RT—PCR方法克隆了山葡萄几丁质酶基因VCH3的全长cDNA片段,并将该基因构建到双元载体pBI121质粒35S启动子下游,形成重组质粒pBIVCH3。通过冻融法将该重组质粒转化到根癌农杆菌LBA4404中,获得了植物表达载体。     

一个葡萄抗逆相关转录因子VvPF1基因的in silico克隆及生物信息学分析

AP2/EREBP是植物所特有的一类转录因子,广泛参与植物生长、发育以及多种生理生化反应的信号传导.本文利用in silico克隆方法获得葡萄VvPF1 基因,并利用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、进化关系、二级及三级结构、功能等方面进行预测和分析.结果表明:VvPF1 是一个含有明显AP2结构域,具有潜在核定位能力的ERF类转录因子.此外,VvPF1与CaPF1, JERF1等抗逆相关的转录因子具有较高的同源性,因此推测,VvPF1很可能参与葡萄对生物和非生物胁迫的信号传导.     

东北山葡萄SSR反应体系的建立及优化

以东北山葡萄(左山二)叶片为材料,对SSR反应体系中的主要影响因子进行了优化。研究了模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶量对扩增的影响。结果表明,在20μL SSR体系中各组分的适宜浓度为:1×PCR buffer,引物0.3μmol/L,模板DNA 30 ng,dNTP 0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U。应用该SSR体系,用3对引物对5份山葡萄材料进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

山葡萄资源性状评价

统计了156份山葡萄资源的产地、花型,分析了果实经济性状。结果表明,来自黑龙江省的种质107份(占68.6%)、吉林省的种质44份(占28.2%)、辽宁省的种质5份(占3.2%);雌能花种质80份(占51.3%)、两性花种质71份(45.5%)、雄株5份(占3.2%);山葡萄种质果皮颜色均为紫黑色;果穗质量最大为140.8g,最小为4.1g,平均为63.4g;果粒质量最大为1.70g,最小为0.41g,平均为0.78g;出汁率最高为65.0%,最低为46.7%,平均为49.6%;浆果可溶性固形物质量分数最高为18.0%,最低为7.5%,平均为13.3%;浆果可溶性糖质量浓度最高为153.2g.L-1,最低为46.9g.L-1,平均为90.9g.L-1;浆果滴定酸质量浓度最高为36.9g.L-1,最低为14.5g.L-1,平均为24.4g.L-1。评价性状表明,吉林省山葡萄资源果实经济性状要稍优于黑龙江省的资源,雌能花山葡萄资源果实经济性状要稍优于两性花资源,但差异不明显。     

山葡萄查尔酮异构酶(VamCHI)基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,从山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)果皮中克隆到查尔酮异构酶(CHI)基因的c DNA全长序列。该基因全长955 bp,包含705 bp的完整开放阅读框,编码234个氨基酸。分子量为25.04 k Da,等电点(PI)为5.21。该基因属于查尔酮超级基因家族,二级结构预测表明,随机卷曲是Vam CHI蛋白质最大量的结构元件,不具有信号肽,属于稳定的亲水蛋白质。氨基酸序列与欧亚种葡萄(NP_001268033)、美洲种葡萄(ACS36662)和显齿蛇葡萄(AGO02170)的同源性较高,相似性分别为98%、98%和91%。     

山葡萄组织培养方法

以经过优选的山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)幼嫩茎段为外植体,对适合植株再生的培养基激素配比、生根基质和生长环境进行了研究。结果表明:最优外植体诱导培养基为MS(改) 0.5mg.L-1BA 0.5mg.L-1KT 0.5mg.L-1NAA;诱导出的愈伤组织容易分化成茎丛,愈伤组织转接到MS(改) 0.5mg.L-1BA 0.1mg.L-1NAA内产生大量的不定芽;不定芽在MS(改) 0.05mg.L-1IBA的培养基内可诱导产生大量的根。生根试管苗驯化、移栽后,生根率最高的基质是苔藓,成活率达90%,而且在室外变温(温度12~30℃)的环境条件下生根最好。     

山葡萄果实发育过程中花色苷含量变化研究

以山葡萄左红一果实为试材,应用HPLC-MS/MS技术,对山葡萄果实发育过程中花色苷种类及含量变化进行了研究。结果表明,转色期前果皮内没有花色苷积累,随着果实成熟,花色苷含量逐渐增加,成熟期含量最高;在山葡萄果实发育过程中检测出花色苷13种,其中双糖苷6种、单糖苷7种。