犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达

【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418 筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高（P＜0.01）,肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高（P＜0.01）。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。     

猪前胸腺素真核表达载体的构建及表达

为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。     

牛DKK2基因pcDNA3.1表达载体的构建

DKK2基因是Wnt信号通路的关键抑制因子,在胚胎发育、颗粒细胞生成等过程中发挥重要作用。扩增了牛DKK2基因CDS序列,构建了DKK2基因pc DNA3.1真核表达载体;为进一步验证载体在细胞内的表达效果,将表达质粒瞬时转染CHO细胞,利用q RT-PCR和Western blot检测DKK2的表达情况。结果表明,在CHO细胞中转染DKK2基因的真核表达载体质粒,其m RNA和蛋白质表达量均显著上升,表明已成功构建了DKK2基因表达载体,为下一步开展DKK2基因功能研究奠定了基础。     

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。     

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。     

兔出血症病毒感染性cDNA真核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建操作更简便的兔出血症病毒(RHDV)感染性cDNA真核表达载体。【方法】在前期构建的RHDV感染性克隆基础上,将其全长cDNA分子分为3段,利用单一的限制性内切酶将其依次克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建RHDV感染性cDNA真核表达质粒,将该质粒转染BHK-21细胞,传3代后,对产生明显细胞病变的细胞冻融液进行RT-PCR检测。【结果】RHDV感染性cDNA真核表达载体构建成功。构建质粒转染的BHK-21细胞出现明显细胞病变,RT-PCR检测结果表明,RHDV拯救成功。【结论】利用真核表达载体可以很方便地拯救出RHDV。     

猪TOLL样受体2基因在CHO-K1细胞中的表达

将含猪TLR2(猪Toll样受体2,pTLR2)基因的真核表达载体PcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2,采用脂质体法转染到CHO-K1细胞,用G418持续筛选获得了阳性细胞克隆.阳性细胞克隆系经PCR和RT-PCR检测表明:pTLR2基因得到稳定整合并能成功地转录.荧光显微镜观察,转染细胞可见绿色荧光,表明获得了表达pTLR2的克隆细胞系.     

籽鹅FSH真核表达载体的构建及表达

为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。     

稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立

以RT-PCR方法从原代猪肺泡巨噬细胞中获得CD163 cDNA序列,然后测序鉴定,对突变碱基进行修正,将修正后碱基序列克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,构建重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163,通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。使用脂质体2000将pcDNA4.0-CD163转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),通过Zeocin抗性筛选,建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系。RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)检测结果表明CD163在mRNA和蛋白质水平均已表达。通过Zeocin抗性筛选,共获得8株表达CD163的重组细胞株,IFA检测结果表明表达的CD163定位于重组细胞的细胞膜表面。去除筛选抗性后连续传代10代,间接免疫荧光检测结果确定重组细胞株在10代内性状稳定,说明稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系构建成功。     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

慢病毒法建立稳定表达HPV-16 E6癌蛋白的肺癌细胞株

目的方法结果结论（HPV）-16 E6DNA HPV-16 E6（PLIG）（PLIG-E6）293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用重组技术将基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体中,获得重组慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定正确后,与慢病毒包装载体一起转染细胞,收集病毒液,测定滴度后,感染肺癌细胞株。经筛选培养周后,提取细胞基因组和蛋白,分别用和方法分析细胞中和蛋白的表达。双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功;感染慢病毒液的细胞中可检测出和蛋白表达。用慢病毒法成功构建稳定高表达癌蛋白的肺癌细胞株。     

含CpG序列PRRSV SD2 E基因真核表达载体质粒构建及表达

为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。     

Pin1真核表达载体的构建及鼻咽癌稳定表达细胞的鉴定

目的 构建Pin1真核表达载体并筛选鼻咽癌稳定表达细胞株.方法 提取HEK293细胞RNA行逆转录,扩增Pin1基因编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA6B中,菌液PCR鉴定并测序;将成功克隆的质粒转染至CNE1细胞,杀稻瘟素筛选和Western Blot鉴定稳定表达Pinl细胞.结果 成功扩增Pin1编码区,并克隆至真核表达载体pcDNA6B中;Pin1过表达载体转染至CNE1细胞并筛选稳定表达细胞后,Western Blotting检测结果显示Pinl表达水平明显增加.结论 成功构建Pin1过表达载体并筛选出鼻咽癌稳定表达细胞,可用于后续研究.     

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

 【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5（MIC-5）和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验（IFA）分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。     

GPC3过表达载体的构建和表达检测

目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。