基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测蛋白质分子量的优化研究

【目的】研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测蛋白质分子量的优化条件。【方法】选择3种不同的基质检测牛血清白蛋白（BSA）的分子量,在选定最佳基质化合物的基础上,通过改变样品蛋白质的浓度,以获得高质量的质谱峰图,确定蛋白质样品的最小和最优检测量。【结果】1 μg蛋白质样品与10 mg/mL含0.1%乙酸（TFA）和50%乙腈（ACN）的芥子酸（SA）基质水溶液混合检测分子量,可产生最高质量的MALDI-TOF-MS峰图,同时蛋白质样品最小检测量应不少于500 ng。【结论】MALDI-TOF-MS技术操作简单、分析快速、灵敏度高,是一种检测蛋白质分子量的可靠方法;研究结果确定了获得最优化质谱峰的最佳组合,这是从高度复杂的蛋白质样品测定准确分子量的必备条件。     

渗透胁迫诱导转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯根系差异蛋白质组学研究

【目的】利用蛋白质组学手段,研究短期渗透胁迫条件下,转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系蛋白质的表达差异。【方法】以水培转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系为材料,用100g/L PEG6000渗透胁迫处理24h,以未胁迫的NT为对照,提取根总蛋白,进行双向电泳分离,考染法凝胶染色,扫描凝胶图像用于软件检测。【结果】在T、NT和对照中分别检测到836,812,881个蛋白点;t测验发现,与对照相比,T和NT有34个蛋白点丰度发生1.5倍以上显著变化(P<0.05,Fold>1.5,Quality>80)。经基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,34个差异表达蛋白点中23个得到了有效鉴定。在鉴定的23个蛋白中,有10个蛋白在T和NT中共同上调或下调表达,包括ATP合酶F1β亚基、烯醇酶、26S蛋白酶体调节亚基6、ACC合成酶2等;另外13个蛋白在T和NT中表达各异,包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶结合蛋白β亚基和蔗糖合成酶等。【结论】10个在T和NT中共同上调或下调表达的蛋白,是甘薯应答渗透胁迫的普遍应答蛋白,反映了T和NT根系对短期渗透胁迫共同的响应机制;另外13个在T和NT中表达各异的蛋白,表明转基因使甘薯根系蛋白质在短期渗透胁迫下表现出特异的响应机制。     

双向电泳技术在植物蛋白质组研究中的应用

双向电泳技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段,是蛋白质组学研究的核心技术之一。综述了双向电泳技术的原理、主要操作方法及其在植物蛋白质组研究中的应用。     

MALDI-TOF MS在不同禽肉动物源性成分检测中的研究

[目的]建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术检测不同禽肉动物源性成分的方法,构建不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,对不同禽肉进行鉴别。[方法]样品用磷酸盐缓冲液提取,净化后用MALDI-TOF MS法测定。采用ChemPattern软件对不同禽肉蛋白图谱进行化学计量学分析,建立识别模型。[结果]鸡、鸭、鹅3种不同禽肉之间具有明显差异。首次建立不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,可一次性对每个样品中鸡、鸭、鹅等肉源性成分进行同时分析。[结论]建立的基于蛋白质组学的鸡、鸭、鹅源性成分鉴定系统具有简便、稳定、准确、重现性好的优点,适用于不同禽肉中鸡鸭鹅动物源性成分的鉴别。     

种蛋孵化早期蛋黄蛋白质组学比较分析

卵黄为发育胚胎提供脂肪、蛋白质等营养物质,直接影响胚胎发育。研究旨在探索胚胎发育早期卵黄蛋白质变化,采用2-DE结合MALDI-TOF MS/MS分析孵化0和10 d种蛋卵黄蛋白质组成。共鉴定出代表10种蛋白质的57个蛋白点丰度存在显著差异(P<0.05),其中8个蛋白点仅存在于0 d卵黄;24个蛋白点仅存在于孵化10 d卵黄;另有25个蛋白点共同存在于0和10 d卵黄中,其中9个点丰度上调、16个点丰度下调。首次检测出卵黄膜外层蛋白1存在于胚胎孵化0和10 d卵黄中。2-DE凝胶图像分析表明,39个蛋白质相对分子质量低于其理论值。生物信息学富集分析表明,4种蛋白质与脂质转运和脂质定位有关,2种蛋白质与抗原结合有关。孵化10 d后卵黄差异蛋白主要参与脂质转运以维持胚胎发育。研究结果有助于进一步了解卵黄蛋白质对胚胎发育的调控机理。     

绵羊肺炎支原体蛋白质组双向电泳图谱的构建

为了建立针对绵羊肺炎支原体蛋白质组学研究的双向电泳图谱及其相关技术体系.采用反复冻融兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解法和超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解法提取绵羊肺炎支原体菌体蛋白,取200μg菌体蛋白利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳,对硝酸银染色后获得的双向电泳图谱进行图像分析.结果表明反复冻融兼Utea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法获得198±2个蛋白斑点,超声兼Urea-CAPS-DTT-SB3-10裂解提取法获得241±2个蛋白斑点.说明超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法提高了双向电泳的分辨率,进而可增强生物质谱鉴定蛋白质的准确度.     

水稻地方品种月亮谷与LTH叶片蛋白质的双向电泳分析

 为了研究水稻地方抗病品种月亮谷与感病品种丽江新团黑谷（LTH）在未接种稻瘟菌前蛋白质间的差异,利用双向电泳技术对月亮谷与LTH叶片的蛋白质组分进行研究。试验选用pH 4～7,17cm的IPG胶条,利用双向电泳技术分离上述两个水稻品种的稻苗叶片的蛋白质,分析其蛋白质点表达量的差异,同时选取差异显著的蛋白质点进行质谱分析。利用Gene ontology软件对这些蛋白质进行了功能分类。月亮谷与LTH叶片蛋白的双向电泳图谱得到34个差异蛋白点,对其中20个蛋白点进行质谱测定,鉴定到13个差异蛋白,包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基,3-磷酸甘油醛脱氢酶,ATP合酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶,铁氧蛋白-NADP-还原酶,叶绿素a/b结合蛋白等。因此认为月亮谷与LTH叶片中主要是参与生长代谢和防御相关的蛋白质存在差异。这些蛋白在水稻与稻瘟病菌互作中的表达模式和对抗病性的贡献值得下一步深入研究。     

基于MALDI-TOF-MS质谱技术对蜂蜜中芽孢杆菌的鉴定与分型

[目的]对分离自不同产地和品种的蜂蜜中的芽孢杆菌属进行鉴定分型,探索利用蜂蜜中芽孢杆菌特征指纹图谱对蜂蜜产地和品种进行溯源的可行性。[方法]从44种不同产地和品种蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌,3株铜绿假单胞菌。采用基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)条件对分离的芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。[结果]44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,短小芽孢杆菌(B.pumilus)5株,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)3株,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)2株,炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)1株,土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri.)2株。通过多次重复试验,表明从同一份样品或同一品牌蜂蜜样品中能稳定分离到芽孢杆菌,获得的蛋白指纹图谱具有极好的稳定性。[结论]MALDI-TOF-MS可根据获得的芽孢杆菌蛋白指纹图谱将芽孢杆菌划分为不同类型,可作为一种新的根据蜂蜜中芽孢杆菌的特征指纹图谱进行溯源的方法。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪在家蚕蛋白质组中的应用

随着家蚕基因组全序列框架图的完成,家蚕蛋白质组学研究也就成了当前家蚕研究的主要方向之一。而双向电泳技术和质谱技术的发展为大规模研究家蚕蛋白质组提供了强有力的平台。近年来,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在蛋白质组学研究中的应用日益广泛,为此着重对其在家蚕蛋白质组学研究中的应用进行探讨。     

虾类蛋白质的双向电泳比较研究

试验以南美白对虾、刀额新对虾、罗氏沼虾为研究对象,利用单向SDS-PAGE凝胶电泳和双向电泳技术建立3种虾类的电泳图谱,建立分辨率高、重复性好的虾肉双向电泳图谱,并进行差异分析。结果表明：比较3种虾类蛋白图谱,发现具有统计学意义和分析意义的差异蛋白点共37个,其中15个蛋白点为南美白对虾的特征蛋白点,而刀额新对虾与罗氏沼虾的特征蛋白点分别为3个,7个。     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼(Dimdcarpus longanaLour.)种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。     

分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化

以分蘖洋葱叶片为试验材料,比较3种不同蛋白质提取方法对2-DE蛋白质双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白上样量、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳重复性进行筛选与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,TCA-丙酮提取法提取分蘖洋葱叶片总蛋白的操作简便,所得双向电泳图谱背景清晰,蛋白质点圆滑,数量及质量均较好,是一种切实可行的提取分蘖洋葱叶片总蛋白方法。应用Image Master 2D Platinum 7.0软件对图谱进行分析,凝胶上检测到超过650多个蛋白质点,不同凝胶之间蛋白质的匹配率达92.5%,具有较高的分辨率和重复性,建立一套适用于分蘖洋葱叶片总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。     

水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析

为比较同一杂交组合不同直链淀粉含量后代在灌浆期胚乳内蛋白表达差异,文章建立了一套适合灌浆期水稻胚乳蛋白的双向电泳技术,探讨了胚乳蛋白的提取、等电聚焦上样量的选择、胶条转移等双向电泳的一些关键技术。结果表明,一次溶解蛋白样品,TCA-丙酮法优于酚法蛋白提取,300μg上样量为最适上样量,能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像。     

牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析

为了建立M.bovis蛋白质组学技术,试验采用M.bovis湖北分离株为实验材料,对样品处理、固相pH梯度胶条、上样量及染色等影响双向电泳图谱质量的关键因素与环节进行一系列的探索,2D Clean-up试剂盒处理的样品400μg在13 cm干胶条(pH 4~7)中进行双向凝胶电泳,考马斯亮蓝R350染色的方法,结果获得了能较好展示大部分蛋白点,分辨率及重复性均很好的双向电泳图谱,应用Image Master 2D Platinum version 6.0软件对图谱进行初步分析,不同重复图谱之间的平均匹配率达80.95%,随机取重复性好的20个蛋白点进行质谱分析,获得19蛋白质点的肽质量指纹图谱,鉴定成功率为95%。质谱鉴定结果与自建M.bovis蛋白库对比,蛋白点匹配率高于82分值限值(P<0.05)的不同蛋白有12个,初步分析这些蛋白多为酶类。说明该技术平台能有效用于M.bovis蛋白质组学的后续研究之中。     

临床型乳房炎奶牛乳清差异蛋白质的双向电泳图谱分析

采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助图象分析方法,对临床型乳房炎奶牛和健康奶牛的乳清蛋白质进行分析和比较,结果表明:在等电点为4~8,相对分子量为15 000-75 000 kD的区域内,临床型乳房炎奶牛乳清中有(128±8)个蛋白斑点,而健康奶牛乳清中有(122±4)个蛋白斑点.对临床型乳房炎奶牛与健康奶牛乳清蛋白质图谱匹配比较发现,有31个蛋白质点表达存在明显差异,其中乳房炎乳清中有7个蛋白点表达发生明显上调,6个蛋白点表达发生明显下调,4个蛋白点没有表达,并且乳房炎乳清新出现了10个蛋白点.     

苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化

比较了苔藓植物小立碗藓3种蛋白样品制备方法,结果分析表明,直接研磨法和三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法检测的蛋白点的数量相差不明显;直接研磨法提取蛋白所得到的2-DE图谱蛋白点模糊,分辨率低,横竖条纹干扰严重;三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法分离效果较好,分辨率有所提高.改良的酚抽提/乙酸铵沉淀法检测的蛋白点远远多于前两种方法,所得到的图谱质量最高,分辨率大大提升,蛋白点分布均匀清晰,横竖条纹干扰也很少,凝胶背景干净,是最佳的小立碗藓蛋白样品制备的方法.     

适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris鄄酚法、三氯乙酸/ 丙酮法和三氯乙酸/ 丙酮+ Tris鄄酚法对其蛋白质提 取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest 软件和质谱对这3 种提取方法得到的双向电泳胶进行分 析。结果显示,三氯乙酸/ 丙酮法得到的蛋白点数量为231 ±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57 ±0.618) mg/ g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。      

寒胁迫诱导灰木相思无性系差异蛋白的表达

本实验提取寒胁迫前后的灰木相思组培苗的水溶性蛋白进行双向电泳和质谱鉴定,分析在寒胁迫条件下蛋白质组的变化。利用ImageMaster 5.0软件分析比较,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定差异蛋白点的肽质量指纹图谱,通过Mascot软件查询Swiss-Prot等数据库,鉴定得到4个显著差异蛋白点,R7、R15、R20表现为上调表达,R17表现为下调表达。结果表明:在寒胁迫条件下灰木相思组培苗存在明显的蛋白质表达差异。     

不结球白菜雌蕊蛋白质双向电泳技术体系的建立

以不结球白菜品种‘矮脚黄’的雌蕊为材料,从蛋白质提取、IEF程序、IPG胶条pH范围和染色方法等方面进行比较,利用Tris-HCl提取方法,使用pH 4～7 IPG胶条和改进的等电聚焦程序,改良银染方法,建立了适用于不结球白菜雌蕊蛋白质的双向电泳技术体系,并使用该体系对开花前2 d的花蕾雌蕊和开花2 d后的雌蕊蛋白质进行比较分析,获得187个差异蛋白点。     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.