小麦-华山新麦草7Ns异附加系的分子细胞遗传学研究

为了给有效利用华山新麦草基因提供新的种质材料,利用细胞遗传学、分子标记等技术,结合田间农艺性状考察,对从小麦-华山新麦草七倍体材料H8911-99与硬粒小麦D4286杂交F4代分离群体中选育的杂交后代12DH25进行了鉴定。华山新麦草基因组特异SCAR标记鉴定表明,12DH25含有华山新麦草遗传物质;有丝分裂和花粉母细胞减数分裂中期I染色体数为2n=44=22Ⅱ,基因组原位杂交(GISH)出现两条杂交信号,且能配对,表明两条外源染色体是华山新麦草的一对同源染色体。选取定位于小麦7个部分同源群上的28对STS标记对12DH25及其亲本基因组DNA进行扩增,定位于小麦第7同源群上的STS标记BE591127和BG274576能在12DH25中扩增出华山新麦草特征条带,将12DH25附加的华山新麦草染色体归属于小麦第7部分同源群。由此确定矮秆材料12DH25是一个稳定的小麦-华山新麦草7Ns二体异附加系。     

小麦-华山新麦草异附加系的细胞遗传学和分子标记辅助鉴定

华山新麦草(2n=2x=14,NsNs)含多种优良基因,是一类具有广阔应用前景的育种资源。为给小麦育种培育新材料,本研究对来自普通小麦品系7182和华山新麦草的高代衍生系H1133、H4122和H1423进行细胞遗传学和分子标记辅助鉴定。细胞学观察表明,3个衍生系的染色体数和构型均为2n=44=22Ⅱ;基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)同步分析结果表明,3个衍生系均含42条普通小麦染色体和2条华山新麦草Ns染色体;EST和PLUG标记分析证明H1133、H4122和H1423中附加的分别为华山新麦草3Ns、5Ns和7Ns染色体,说明H1133、H4122和H1423分别为小麦-华山新麦草的3Ns附加系、5Ns附加系和7Ns附加系;形态学鉴定结果表明,三个附加系与亲本7182在株高、分蘖和穗长等农艺性状上表现出不同差异;成株期抗条锈病鉴定结果表明,H4122和H1423高抗CYR32和CYR33混合菌种,从材料系谱推断其抗性来源于华山新麦草。总之,附加系H1133、H4122和H1423在农艺性状和抗病性上均有良好表现,可作为小麦育种中的桥梁材料。     

小麦-华山新麦草易位系24-6的鉴定

为给小麦-华山新麦草远缘杂交育种提供材料和理论基础,对普通小麦与华山新麦草杂交后代中选育出的材料24-6进行了形态学观察、细胞学检测和原位杂交(GISH)分析。结果表明:(1)通过根尖细胞学鉴定,该材料染色体数为42条,2n=42;(2)以华山新麦草Ns基因组DNA为探针,普通小麦7182基因组DNA为封阻,根尖与花粉母细胞原位杂交(GISH)显示该材料携带有2条可以配对的华山新麦草染色体臂,确定24-6为稳定的小麦-华山新麦草易位系;(3)田间观察发现24-6植株紧凑,叶色深绿,籽粒白色、呈半角质,比其母本(普通小麦7182)株高略有降低,穗长、小穗数、穗粒数、千粒重、分蘖数都有所增加。     

附加华山新麦草不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其生理机制分析

为了解附加华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其相关生理机制,以小麦-华山新麦草全套二体附加系及其亲本7182为研究对象,对其进行150 mmol·L^-1、250 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫处理,测定其芽期和苗期的7个生长指标及6个理化指标,并进行分析比较。结果表明,盐胁迫下,供试材料芽期的芽长（SL）和根长（RL）、苗期的叶片鲜重（FW）下降最为明显;4Ns、5Ns、7Ns附加系在芽期、苗期的耐盐性显著高于受体小麦7182,其中7Ns附加系耐盐能力最强,150 mmol·L^-1和250mmol·L^-1NaCl胁迫下,耐盐等级分别为Ⅰ级（高耐）和Ⅱ级（耐盐）。盐胁迫下,5Ns、7Ns附加系叶片内SOD、POD活性最高,且叶片丙二醛（MDA）含量最低,相对电导率最小;4Ns附加系脯氨酸含量较高,丙二醛含量较少。可以认为,华山新麦草4Ns、5Ns、7Ns染色体附加到小麦后,分别依赖渗透调节、抗氧化机制增强受体小麦的耐盐能力,这些附加系材料可作为新种质应用于小麦耐盐性研究和育种。     

普通小麦-华山新麦草1Ns二体异附加系的分子细胞遗传学研究

为给后续研究和利用普通小麦-华山新麦草衍生后代H1-1-3-1-9-8提供依据,用形态学、细胞学及分子生物学方法对该材料进行分析研究。结果表明,H1-1-3-1-9-8在株高、穗长、穗型等性状上与华山新麦草无显著差异,千粒重平均44.2 g,较亲本显著增加;H1-1-3-1-9-8的染色体构型为2n=44=22Ⅱ;经原位杂交鉴定,H1-1-3-1-9-8存在两条华山新麦草外源信号,且能够配对;选取普通小麦7个部分同源群上的64对EST-STS引物对H1-1-3-1-9-8进行分析,第一部分同源群上的BE443796、BE446010、BE497584、BF202643、BG262410、BG607965和BM140362七对引物扩增出了华山新麦草的特异条带;经种子贮藏蛋白变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,H1-1-3-1-9-8具有华山新麦草特有的高分子量谷蛋白亚基。以上结果说明,H1-1-3-1-9-8是普通小麦-华山新麦草1Ns二体异附加系。     

华山新麦草2Ns染色体SCAR标记的开发

为准确快速地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,利用180条长度为10 bp的随机引物R1~R180对小麦-华山新麦草全套（1Ns~7Ns）二体附加系及其亲本华山新麦草和普通小麦7182共9个材料进行了RAPD分析。结果表明,R131在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中可以扩增出特异条带。将该特异条带回收并测序,发现其全长为1 126 bp,对其进行序列比对分析后设计SCAR引物S131,然后利用S131重新对9份材料进行了SCAR分析。结果显示,S131只在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中扩增出特异性条带,表明RAPD标记R131已成功转化为可靠、特异的SCAR标记S131。这个新的SCAR标记可用于检测普通小麦背景下华山新麦草2Ns染色体。     

普通小麦 华山新麦草衍生后代H18和0841的SSR标记鉴定

为了明确普通小麦华山新麦草衍生后代材料中所携带的外源遗传物质,利用SSR标记对普通小麦-华山新麦草衍生后代H18和0841进行了鉴定.SSR标记结果表明,331个SSR标记中有271个在亲本华山新麦草和普通小麦7182间具有多态性;85个在华山新麦草中具有清晰且明亮的特异条带,其中9个标记在H18衍生的8个单株中(2n=51～54)具有华山新麦草特征条带.0841的染色体数目为42条,利用筛选的9个标记对其鉴定,发现定位于小麦3D染色体上的标记Xbarc71在0841中具有华山新麦草的特异条带,同时缺失小麦亲本7182的特异条带,推测0841可能是华山新麦草的3Ns染色体代换了小麦的3D染色体.条锈病抗性鉴定显示,0841中抗至高抗条锈菌条中31号和条中32号混合小种.     

华山新麦草3Ns染色体特异SCAR标记的开发

为快速准确地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,采用150条10bp的随机引物R1-R150对华山新麦草、普通小麦7182、中国春及华山新麦草1Ns-7Ns全套二体附加系共10个材料进行了RAPD分析,从中获得了华山新麦草3Ns染色体上2个特异RAPD分子标记片段FR-113和FR-125。克隆这两个片段并测序,发现其全长分别为543bp和515bp;分析序列后对其分别设计SCAR引物S-113和S-125,重新对10个材料进行SCAR分析,结果只在华山新麦草和小麦-华山新麦草3Ns二体附加系上扩增出了特异条带,由此证明已将华山新麦草3Ns染色体上获得的两个RAPD标记成功转化为稳定可靠的SCAR标记。这两个SCAR标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草3Ns染色体,同时为小麦-华山新麦草杂交后代提供了分子鉴定依据。     

三个小麦-华山新麦草二体附加系分子细胞遗传学的初步鉴定

华山新麦草是我国华山地区特有小麦近缘物种，具有抗逆、早熟、优质等特点，对小麦的白粉病、条锈病、赤霉病也具有良好的抗性，是小麦重要的三级基因库。为进一步更好地发挥华山新麦草基因资源的作用，本研究利用细胞学方法、原位杂交技术、分子标记技术、农艺性状评估和抗病性鉴定对普通小麦-华山新麦草衍生后代材料进行鉴定，并获得了 20H11、17H21、18H28 三个小麦-华山新麦草衍生系。结果表明，20H11、17H21 和 18H28 的染色体数都是 44 条，均携带2 条属于华山新麦草的 Ns 染色体和 42 条普通小麦染色体。利用华山新麦草的特异分子标记进行检测，证明 20H11、17H21 和 18H28分别为 3Ns、4Ns和 2Ns二体附加系。通过农艺性状调查，3个试验异染色体系与亲本7182相比，株高和小穗粒数的差异不显著；分蘖数目与亲本7182有显著差异；20H11的穗长显著短于亲本7182；17H21的分蘖数显著少于亲本7182。经条锈病抗性鉴定，18H28 高抗条锈病小种 CYR32 和 CYR34。因此，这三个华山新麦草衍生系可作为中间材料用于小麦遗传育种研究。     

小麦-冰草二体附加系的细胞学稳定性研究

为了研究小麦-冰草二体附加系的细胞学稳定性,采用细胞遗传学技术,对20个小麦-冰草二体附加系开放授粉后代的染色体数目进行了分析。结果表明,在所检测的20个二体附加系后代中,细胞学稳定性存在较大的差异：在10份材料中检测到2n=44植株的平均频率为74．78％,传递率为33．3％～100％;在10份材料的后代植株中没有检测到2n=44的植株,通过GISH分析,在这些后代中检测到1个代换系5111—1和1个易住系5112-4。说明在二体附加系后代中2n=42的个体,并不一定表示冰草染色体的完全丢失,而可能以其它形式(如代换、易位等)存在于小麦核背景中。同时,还讨论了冰草属P基因组在小麦族中的地位。     

普通小麦-中间偃麦草易位系08-738的鉴定

中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n=42)具有大穗多花和抗多种病害等特性,是小麦育种的重要基因资源之一。为确定普通小麦川麦107与中间偃麦草杂交获得的遗传稳定品系08-738的染色体组成,采用形态学、细胞遗传学和SSR分子标记对其进行了鉴定。形态学分析表明,08-738具有植株较矮和小穗数较多的特点。细胞学观察表明,其染色体数目及构型为2n=42=21II。基因组原位杂交(GISH)和重复序列原位杂交(FISH)结果表明,08-738含有20对小麦染色体和1对小麦-中间偃麦草小片段易位染色体,易位位于小麦3DS的近末端,且该外源片段可能来源于中间偃麦草的Js染色体组。SSR标记分析显示,位于3DS 6-0.55-1.00之间的SSR标记xcfd141能在08-738和中间偃麦草之间扩增出一条特异条带,xcfd141可作为该中间易位片段鉴定和选择的标记。     

普通小麦与Elymus rectisetus衍生后代的细胞遗传学和形态学研究

披碱草（Elymus rectisctus,以下简写为E．rectiselus)具有二倍性无融合生殖特性,为了获得小麦-E．rectisetus稳定的异附加系或异代换系,对(小麦-E．rectiselus)BC2F2衍生后代的细胞学和形态学进行了研究。结果表明,在BC2F5～BC2F7镜栓的单株中,体细胞染色体数目在22～50条之间,其中42条和44条染色体所占的比例最大,分别占鉴定植株总数的38．0％和35．9％。三个2n=42=21″的稳定株系与普通小麦Fukuhokomugi杂交F1的花粉母细胞染色体构型为2n=18″ 6′,表明有三对E．rectiselus染色体代换到普通小麦中;三个2n=44=22″的稳定株系与Fukuhokomugi杂交F1的花粉母细胞染色体构型为21″ 1′,表明它们为二体异附加系。此外,衍生后代的形态学特征趋向于普通小麦。     

华山新麦草穗发芽抗性相关基因AIP2的克隆及其序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NsNs)的优良基因,拓宽小麦穗发芽抗性基因资源,以华山新麦草为材料,采用同源克隆的方法克隆AIP2基因,利用生物信息学软件分析其基因结构及功能。结果表明,从华山新麦草中成功克隆AIP2基因,该基因的开放阅读框为840bp,编码279个氨基酸残基,结构域预测结果显示AIP2蛋白含有完整的Ring保守域,属于锌指环家族成员。AIP2的gDNA含5个外显子,4个内含子,华山新麦草AIP2氨基酸序列与感穗发芽小麦品种中优9507的AIP2氨基酸序列的相似性为84%,与中优9507相比缺失了44个氨基酸,与抗穗发芽的乌拉尔图小麦的AIP2氨基酸序列的相似性为80%,华山新麦草和乌拉尔图小麦都有氨基酸缺失,推测这些缺失的氨基酸可能与华山新麦草穗发芽抗性强有很大关系。本研究为小麦穗发芽抗性改良提供了新的候选基因。     

小麦-茸毛偃麦草异附加系Y176-3的分子细胞遗传学鉴定

为了解茸毛偃麦草（Thinopyrum intermedium ssp.trichophorum）与小麦经过杂交、回交所选育的小偃麦新种质Y176—3的遗传特性，对该系进行了抗条锈性鉴定与：分子细胞学分析。结果表明，Y176—3对当前的条锈病流行小种和新小种免疫。其根尖细胞染色体数目为2n=44，有2对随体，花粉母细胞减数分裂中期I（PMCMI）染色体构型为2n=22Ⅱ。利用C-带分析，观察到Y176-3中可能附加了一对来自茸毛偃麦草的端部有强带的短染色体。以拟鹅观草（Pseudoroegneria spicata，2n=14）DNA作探针、中国春基因组DNA为封阻进行的原位杂交结果表明。Y176-3含有2条较短的茸毛偃麦草染色体，该染色体属于St组，推测新种质Y176-3中导入的来自茸毛偃麦草的St染色体可能携带新的抗条锈病基因。     

小麦-中间偃麦草衍生系的分子细胞遗传学鉴定

对阿勃缺体与小麦-中间偃麦草部分双二倍体中2经杂交、回交选育的两个衍生系(衍生系Ⅰ和衍生系Ⅱ)研究表明,两个衍生系在形态学和细胞学上已经基本稳定,细胞学鉴定结果均为2n=44=22″。两个衍生系与阿勃二体杂交F1花粉母细胞染色体构型以及基因组原位杂交结果表明,衍生系Ⅰ为小麦-中间偃麦草异代换-附加系,衍生系Ⅱ为小麦-中间偃麦草异附加系。     

小麦-中间偃麦草代换系中233的分子细胞学鉴定

为了从小麦-中间偃麦草衍生后代中获得具有优良性状的新种质,利用细胞学和分子标记技术对中间偃麦草衍生系中233进行鉴定。结果表明,中233的根尖细胞染色体数为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的染色体通常配成21个二价体。以中间偃麦草基因组DNA为探针、中国春基因组DNA为封阻进行基因组原位杂交(GISH)分析发现,中233含有2条中间偃麦草染色体和40条小麦染色体,在减数分裂中期I,两条中间偃麦草染色体可以正常配对。利用D基因组特异探针pAs1进行荧光原位杂交(FISH)分析发现,中233缺少了一对小麦的2D染色体。分子标记鉴定进一步表明,中233的1对小麦2D染色体被中间偃麦草染色体所代换。说明中233是一个细胞学稳定的小麦-中间偃麦草二体代换系,初步推断其可能携带有中间偃麦草的优异基因。     

普通小麦-长穗偃麦草抗白粉病异代换系的分子细胞学研究

禾本科布氏白粉菌引起的小麦白粉病是造成小麦显著减产的主要病害之一.小麦的野生近缘种植物十倍体长穗偃麦草(2n=10x=70)携带有抗白粉病基因.为了进一步研究长穗偃麦草携带的抗白粉病基因,本研究对普通小麦-长穗偃麦草异代换系A1-2-2-2进行形态学、白粉病抗性、细胞学、分子标记及原位杂交(GISH)鉴定分析.结果表明,A1-2-2-2在苗期和成株期均对白粉病表现为免疫;减数分裂中期染色体构型为2n=21Ⅱ;分子标记鉴定结果表明,A1-2-2-2可能缺失了1对普通小麦的6A染色体;原位杂交结果表明,A1-2-2-2可能携带1对来自十倍体长穗偃麦草的St染色体.综上所述,A1-2-2-2可能为小麦的6A染色体被长穗偃麦草的1对St染色体取代的异代换系.另外,A1-2-2-2表现为毛颖,而双亲均表现为光颖,推测光颖由6A染色体上的基因控制.     

基于TRAP的长穗偃麦草SCAR标记的开发及应用

为了开发长穗偃麦草的特异标记,依据TRAP技术,利用56对固定引物与随机引物的组合对中国春-长穗偃麦草附加系等材料进行PCR扩增,共筛选出160条分布于长穗偃麦草1E-7E染色体的特异扩增片段。通过对104个片段的序列进行同源比对,选择与小麦无同源序列的区段设计138对引物,分别对中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草附加系进行PCR扩增,最终获得30个长穗偃麦草特异SCAR标记,发展标记的效率为53.6%。利用这些特异SCAR标记对硬粒小麦(AABB)与异源六倍体小麦(AABBEE)杂交产生的F2中38个单株进行扩增鉴定,9个单株仅附加了1条相同的E染色体,其余为多条E染色体或者无E染色体附加。这些SCAR标记在不同材料和世代表现出优越的特异性和稳定性,可用于检测小麦背景中附加的相关长穗偃麦草染色体。     

普通小麦和华山新麦草衍生系H9021对全蚀病抗性的遗传分析

为了解普通小麦和华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NN)衍生系H9021对全蚀病抗性的遗传特点,利用IECM算法对H9021×96(15) F2分离群体的抗病性进行了估算[96(15)为感病材料].结果表明,H9021对全蚀病抗性的遗传模型为B-1,即抗性由两对主基因+多基因控制,主基因表现为加性-显性-上位性模型,两个重复中F2群体控制抗性的主基因遗传率分别为96.7%和94.6%.     

华山新麦草特异重复序列的筛选、克隆及Southern杂交分析

为了寻找华山新麦草特异重复序列,以华山新麦草、栽培一粒小麦、栽培二粒小麦、野生一粒小麦、野生二粒小麦、圆锥小麦、阿拉拉特小麦、茹科夫斯基小麦、斯卑尔脱小麦、普通小麦"中国春"(CS)为材料,利用200条RAPD引物筛选出11条华山新麦草特异条带(命名为RHS1~RHS11),并对这些条带进行回收、克隆、测序。将序列在NCBI数据库中进行比对,其中RHS1、RHS2、RHS3、RHS4、RHS6、RHS8、RHS9在NCBI数据库中未发现与其同源的序列。RHS5、RHS7、RHS10、RHS11在NCBI数据库中有相似序列,其最高覆盖度和最高相似性分别为:83%和100%、99%和85%、49%和100%、19%和83%。通过Southern blotting进行序列特异性检测,RHS1、RHS2、RHS4、RHS6和RHS9等5个克隆在10种材料中都没有杂交信号;RHS7、RHS10和RHS11在华山新麦草及其他9种材料中都有弥散分布的杂交信号;RHS3、RHS5和RHS8只在华山新麦草中有杂交信号的序列。这些结果说明RHS3、RHS5、RHS8为华山新麦草基因组特异重复序列。