农业微生物制剂的活性菌分离与鉴定

微生物制剂是以自然界中分离的有益菌为主体开发的产品,在健康、环保及农业生产上应用广泛。某农业微生物制剂在海南的热带农业生产中能显著增产和增强作物抗性,为了了解该微生物制剂的作用机制,本研究采用平板划线法对活性菌进行分离和纯化,对分离菌株进行生长、形态及显微观察,对16S rDNA进行序列PCR扩增、测序及生物信息学分析,鉴定活性菌的种属。结果表明,分离得到2个形态不同的细菌菌株,通过形态观察及16S rDNA序列的分子鉴定,发现这2个菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有99.9%的同源性;2个菌株的16S rDNA序列的比较结果发现它们有7个碱基的差别,说明这2个菌株可能是不同的生理小种。     

一株具有抗菌活性红树林土壤放线菌的分离和鉴定

分离和鉴定具有抗菌活性的红树林土壤放线菌。基于形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,研究通过稀释分离法从广西北海红树林的高盐泥样中分离到1株细菌。系统进化分析表明,分离菌株与链霉菌属Aurantiogriseus AY999773具有99%的同源性,因此,BH0951初步被鉴定为链霉菌属Aurantiogriseus AY999773的变种。说明放线菌BH0951具有抗菌活性,本研究能为本菌株乃至广西北海红树林的微生物资源的开发和利用提供初步数据。     

观音土曲乳酸菌的分离与分子鉴定

[目的]指导白酒生产,提高白酒质量。[方法]采用平板分离法从观音土曲中分离到7株乳酸菌（B1~B7）,测定其发酵产乳酸的量。选取乳酸产量最高的1株菌B7,提取其DNA并进行16S rDNA的PCR扩增、克隆、测序。从GenBank中选取与B7同源性最高的典型菌株,下载其16S rDNA序列,采用邻位相连法构建进化树。[结果]B1~B7的产乳酸量分别为：24.7、20.7、30.7、15.2、9.5、21.8、35.7mg/100m l;对B7的基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增,并对纯化后的扩增产物进行TA克隆,阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳后在3000和1 600 bp处出现电泳条带,说明B7的16S rDNA PCR扩增产物已克隆到测序载体上。同源性分析结果表明,B7为乳杆菌属的短乳杆菌。[结论]该研究从观音土曲中分离到1株高产乳酸菌——短乳杆菌。     

具有抗菌活性红树林土壤放线菌BH0951的分离和鉴定

以广西北海红树林高盐泥样为材料,采用高氏1号培养基对其中的菌株进行分离纯化,通过抗菌试验筛选出1株放线菌BH0951,该菌株的发酵产物具有较强的抗菌活性,其最适生长温度为28℃,最适生长pH值为7.0。提取其总DNA,采用通用引物对其16S rDNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定。结果表明,BH0951为链霉菌属（Streptomyces aurantiogriseus）AY999773的变种。     

脂肪酶菌种的筛选及分子鉴定

通过固体平板法,从温泉水样中筛选出1株耐热脂肪酶产生菌X-33。对该菌株进行了产酶条件的初步探索,得出其摇瓶发酵条件为：2%可溶性淀粉,3%酵母膏,MgSO4·7ddH2O 0.1%,K2HPO40.1%,三丁酸甘油酯乳化液0.1%,起始pH值7.5,通气量50 mL/250 mL摇瓶,250 r/min,发酵温度37℃,发酵周期24 h。该酶在60℃条件下温浴30 min,可保留部分活性。为鉴定该菌株,克隆并测序了其16S rDNA基因序列,NCBI上比对分析表明,该菌株与sphingomonas yabuuchiae（鞘氨醇单胞菌）有最紧密的亲缘关系。     

一株产紫红色色素的沙雷氏菌的分离与鉴定

[目的]为有效预防和控制由沙雷氏菌引起的多种疾病提供依据。[方法]以华蓥山香菇作为研究材料,从其表面中分离出了1株产紫红色色素的细菌,采用形态学、生理生化方法对其进行初步鉴定;提取基因组DNA,采用16S rRNA的通用引物,PCR扩增16S rDNA基因片段,克隆入pMD-18T载体,转化E.coliDH5α,筛选阳性重组质粒鉴定后测序;通过多序列比对和同源性分析,构建系统发育树。[结果]该菌株革兰氏染色阴性,与沙雷氏菌属菌的同源性最高,命名为Serratiasp.JG05。扩增得到序列大小为1 506 bp,系统发育树表明JG05与Serratiasp.BBTR23的亲缘关系最近,核苷酸水平有99.20%的相似性。[结论]该研究为进一步研究这种附生菌与香菇的共生关系,以及它们之间的作用机制奠定了基础。     

兔源抗动物腹泻益生菌Tu-1的分离、鉴定及耐受性研究

本研究旨在从健康兔肠道内分离出一株对大肠杆菌有拮抗活性的菌株,并对其鉴定到属。选用平板抑菌圈法,从兔子盲肠中分离得到64株对大肠杆菌有拮抗作用的细菌,对其中14株拮抗作用较强的菌株进行了复筛,其中抑菌圈直径大于20mm的4株,抑菌圈直径在15mm~20mm的8株,另外2株拮抗作用较小,其中Tu-1对大肠杆菌的拮抗作用最强,抑菌圈直径达到21.4mm。在耐受性实验中,Tu-1对酸性环境、胆酸盐和高渗透压均表现出耐受性。对其形态及生理生化特征进行了研究分析,发现与芽孢杆菌相似,将所测得的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对,选取序列相似性高的菌株,用Clustal X(1.8)软件进行16S rDNA相似性分析,Neighbor-Joining法构建系统发育树。Tu-1与Bacillus velezensis的相似性水平均达到99.77%,鉴定该菌为Bacillus velezensis。     

药用植物细叶石仙桃内生细菌的分离和分子鉴定

以采自雁荡山、白岩山和划岩山3个样地的细叶石仙桃为材料,在分离和培养内生细菌的基础上,利用分子生物学手段对其进行鉴定。研究结果表明,共分离到13种内生细菌,它们来自果胶杆菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、科泽氏菌属、藤黄色杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属等9个属;栖稻假单胞菌和胶质类芽孢杆菌为雁荡山细叶石仙桃特有,韦氏芽孢杆菌为划岩山细叶石仙桃特有。     

基于16S rDNA序列4株鸡源芽孢杆菌的分子鉴定

对分离自肉鸡肠胃的4株芽孢杆菌R1、R2、S1、H1的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在NCBI中通过Nucleotide BLAST查找其同源序列,应用DNAstar的MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V 、Clustal W3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega5.0软件中的最大似然法、邻接法、最小进化法、最大简约法构建系统发育树.序列差异和同源性分析结果显示:由Jotun Hein法可知,H1和R2与Bacillus subtilis DSM10同源性最高,达到100％;R1与B.vallismortis DSM11031同源性最高,达到99.7％;H1与B.subtilis DSM10的同源性为99.9％.由Clustal V法可知,H1与R2同源性最高,达到99.6％;R1与S1同源性最高、为98.7％.由Clustal W法可知,H1与R2同源性最高、为99.7％,R1与S1为99.4％.采用4种方法构建的系统发育树基本一致,可以确立4株鸡源芽孢杆菌的分类地位,R1、S1与B.subtilis BPRIST009、B.subtilis LXB3、B.vallismortis DSM11031之间关系最为亲近;R2、H1与B.subtilis CICC10076、B.subtilis DSM10之间关系最为亲近.     

斑马鱼肠道细菌的16S rDNA分子鉴定及PCR-SSCP分析

为了解斑马鱼Danio rerio肠道细菌多样性,采用细菌分离纯化、16S r DNA基因分子鉴定技术,对斑马鱼肠道细菌进行PCR-SSCP分析。结果表明:从斑马鱼肠道分离纯化出12株细菌,分别命名为Zf1、Zf2、Zf3、Zf4、Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和Zf12,其中对7株分离菌构建p MD18-T/16S r DNA的阳性克隆测序显示,Zf1、Zf11菌株与Aeromonas veronii的16S rDNA序列一致性为99%,Zf4、Zf8菌株与Sphingomonas sp.的一致性为99%,Zf5菌株与Bacillus subtilis的一致性为99%,Zf7菌株与Aeromonas sp.M10的一致性为99%,Zf10菌株与uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01的一致性为92%;16S r DNA分子鉴定表明,Zf1、Zf7和Zf11属于气单胞菌属Aeromonas,Zf4、Zf8属于鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas,Zf5属于芽孢杆菌属Bacillus,Zf10为一种新菌株;采用PCR-SSCP技术对12株细菌16S r DNA基因V3区进行多态性分析,结果显示,斑马鱼肠道细菌16S r DNA基因V3区存在多态性,其中Zf1与Zf11菌株带型一致,Zf4与Zf8菌株带型一致。本研究结果可为揭示鱼类肠道菌群结构对其生命活动的影响提供科学参考。     

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

一株正二十二烷降解菌的分离及鉴定

[目的]研究正二十二烷降解菌的分离及鉴定。[方法]以正二十二烷无机盐培养基为选择培养基,从南充市炼油厂曝气池的回流污泥中筛选出1株高效降解长链烷烃的菌株,命名为T2,并对其进行形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA比对以及17种药物敏感试验。[结果]T2菌株鉴定为沙雷氏菌属。在正二十二烷浓度为1%（W/V）无机盐培养基中接入1%种子液,并在30℃和180 r/min摇瓶震荡下培养6 d,正二十二烷降解率可达70%。药敏试验表明,T2菌株对链霉素、卡拉霉素、大观霉、氯霉素、氧氟沙星、庆大霉素、恩诺沙星、新霉素、阿米卡星、复方新诺明高度敏感;对环丙沙星为中度敏感;对青霉素G、氨苄青霉素、四环素、乙酰螺旋霉素、克林霉素、阿莫西林不敏感。[结论]该研究为石油污染的生物处理提供良好的微生物菌种资源。     

鲜牛奶中植物乳杆菌D14的分离鉴定

[目的]从鲜牛奶中分离植物乳杆菌,为牛奶中植物乳杆菌的开发利用提供依据。[方法]将鲜牛奶稀释,进行涂布转接,再通过活菌培养、形态特征观察、生理生化试验,结合16S rDNA序列分析进行鉴定。[结果]从鲜牛奶中分离得到1株细菌（D14）,菌体形态为杆状,单个或链状排列,无芽孢,菌落凸起,边缘光滑细腻,呈白色,直径0.4～2.2 mm,有酸味。再结合各生理生化试验和16S rDNA序列分析,将其鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。[结论]从鲜牛奶中分离得到的植物乳杆菌D14来源安全,有望应用于食品和饲料发酵,具有一定的应用前景。     

基于16S rDNA序列的4株气单胞菌属细菌的分子鉴定

对分离自养殖水环境的4株气单胞菌属(A eromonas)细菌的16 S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,通过BLAST软件在GenBank中查找同源序列,应用MegAlign软件中的Jotun Hein、ClustalV以及ClustalW 3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega 4.0软件中的邻接法(NJ)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树.由Jotun Hein法可知,Aeromonas sp.T3与序列DQ817542.1、DQ817645.1以及HM127065.1相似度最高,均为99.2％,Aeromonas sp.T4与序列DQ816364.1、HM77846.1以及HM778618.1相似度最高,均为97.9％,A eromonas sp.T5与序列GQ205446.1相似度最高,均为99.4％,Aeromonas sp.T6与序列GQ205446.1相似度最高,为99.6％;其他两种方法的结果相似度略低.4种方法构建的系统发育树基本一致,可初步确立4株菌株的分类地位:Aeromonas sp.T3与序列DQ817542.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T4与序列HM778618.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T5与序列GQ232759.1亲缘关系最近,Aeromonas sp.T6与序列GQ205446.1亲缘关系最近.     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

贵州地区土壤中需氧放线菌的分离鉴定

为了解贵州土壤需氧放线菌的分布特点、系统发育和物种多样性,采集贵州贵阳、遵义、安顺、铜仁、毕节、黔南、六盘水、黔东南、黔西南9个区域的农耕地、湿地、森林3个类型土壤标本进行需氧放线菌的分离纯化,扩增其16S rDNA 基因序列后在 GenBank 中进行 Blast 比对分析,并以邻接法构建系统发育树。结果表明：在贵州9个区域108份土壤中分离出173株需氧放线菌,其中链霉菌属（Streptomyces）165株、北里孢菌属（Kitasatospora．）5株、诺卡氏菌属（Nocardioides）2株,在遵义农耕地土壤中分离出链霉菌属潜在新种1株（GYM8-3）。贵州土壤需氧放线菌主要为链霉菌属,在种间水平上存在分类多样性和地域差异性。     

25株植物内生放线菌的系统发育分析

[目的]初步确定25株植物内生放线菌的种属关系。[方法]采用改进的FRED法从小麦、大葱、油菜等植物中分离出的25株内生放线菌中提取基因组DNA,对其16S rDNA序列进行PCR扩增和测序,并对其进行系统发育分析。[结果]系统发育分析结果表明25株植物内生放线菌可分为5个属,其中1株糖霉菌属,2株拟诺卡氏菌属,7株诺卡氏菌属,10株小单孢菌属和5株链霉菌属。[结论]25株供试菌株中,小单孢菌属所占比例最高。供试内生放线菌与相应菌属中已知菌株之间的进化距离集中在97.39%~99.92%范围内。