A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析

 【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒（AIV）的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒（IAV）流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型 AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2 IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV 的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV 的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。     

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆,测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp.同源性分析表明A/Duck/XJ/4(H5N1)株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性(86.3%～99.6%).与人源毒株相比,PB2和PA与A/HK/156/97(H5N1)株的同源性较低(86.3%～88.7%);与A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)株和A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)株的同源性较高(93.0%～98.8%);PB1与人源毒株A/HK/156/97(H5N1)、A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)、A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)同源性为91.1%～93.2%.     

PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。     

马铃薯微生物菌剂的应用效果及对根际土壤微生物的影响

将离体条件下对马铃薯晚疫病菌和丝核病菌具有较强抑菌活性的枯草芽孢杆菌PB12菌株以拌种和颗粒底肥方式施用,结果对马铃薯出苗和幼苗生长均具一定促进作用,可降低马铃薯晚疫病病情指数,且增产效果明显,并可提高马铃薯根际土壤细菌数量,降低真菌数量,促进马铃薯根际土壤的微生态平衡。     

激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达基因片段的分析

【目的】从基因组水平筛选不结球白菜中受激发子PB90诱导过敏性细胞死亡早期上调表达的基因。【方法】采用抑制性差减杂交的方法筛选疫霉菌激发子PB90注射处理不结球白菜叶片5 h内上调表达的基因。【结果】测定分析了200个上调表达的cDNA片段,生物信息学分析表明它们包含70个上调表达的基因片段,共分为9类：基本能量或代谢产物;蛋白质合成分解;细胞信号传导;细胞凋亡;转录;运输相关和编码未知功能的蛋白等。进一步用半定量RT-PCR分析了候选基因beclin,thioredoxin,HLA-B,MAP3K,SPT1, SPT2和AGO1,表明这7个基因在PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达。【结论】构建了疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期抑制性差减杂交cDNA文库,获得了70个上调表达的基因,并对其中7个基因的可能功能进行预测分析,认为这些基因可能与疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡有关。这些基因的挖掘为进一步阐明过敏性细胞死亡的分子机制提供了素材。     

A型流感病毒H7N9株PB1和PB2基因的克隆和真核表达

【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-Flag-PB1/PB2真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定PB1/PB2蛋白的表达。【结果】成功克隆了PB1和PB2全长基因,构建了A型H7N9流感病毒PB1和PB2蛋白真核表达载体pRK-Flag-PB1/PB2,并在293T细胞中转染表达,Western blot确定了PB1/PB2蛋白的成功表达。【结论】该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达PB1和PB2蛋白,为后期开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用的研究奠定了基础。     

畜禽肠道梭菌的克星——克洛生粉剂

克洛生是从健康鸡的肠道中分离出来的枯草芽孢杆菌属的PB6菌株。该菌株在肠道中定植后分泌的脂蛋白可以抑制多种引发肠炎的产气荚膜梭菌的繁殖。PB6菌株对高温和酸碱度具有很好的耐受性。饲料中添加的有机酸和抗球虫药等成分均不会对PB6菌株产生抑制作用。与抗生素相比较,克洛生在抑制有害微生物繁殖的同时,     

PB中的图像处理技术

分析了Windows环境下PB通常处理图像的方法的不足（不适宜处理大图像等）。给出了一种处理大图像的方法，即使用ole2,并调用专用看图软件ACDsee。     

PB与SQL Server数据库的连接

PB作为目前常用的一种数据库应用开发工具，在连接数据库的方法上，总地来说分为两类：ODBC接口和专用接口。本文以连接SQL Server数据库为例，介绍了PB连接数据库的这两种方法。     

Accumulation characteristic of protein bodies in different regions of wheat endosperm under drought stress

The structural characteristics of protein body accumulation in different endosperm regions of hard wheat cultivar(XM33) and soft wheat cultivar(NM13) under drought stress were investigated. Drought stress treatment was implemented from plant regreening to the caryopsis mature stage. Microscope images of endosperm cells were obtained using resin semithin slice technology to observe the distribution and relative area of protein body(PB). Compared with NM13, relative PB area of XM33 was significantly higher in sub-aleurone endosperm region. The amount of accumulation, including the size and relative area of PB, in two wheat cultivars was higher in sub-aleurone region than that in central region at 18 days post anthesis(DPA). Drought stress significantly enhanced the sizes and relative areas of PBs in the dorsal and abdominal endosperms in two wheat cultivars. Particularly for dorsal endosperm, drought stress enhanced the relative PB area at 18 DPA and NM13(5.0% vs. 6.73%) showed less enhancement than XM33(5.49% vs. 8.96%). However, NM13(9.58% vs. 12.02%) showed greater enhancement than XM33(10.25% vs. 11.7%) at 28 DPA. The protein content in the dorsal and abdominal endosperms of the two wheat cultivars decreased at 12 DPA and then increased until 38 DPA. Drought stress significantly increased the protein contents in the two main regions. From 12 to 38 DPA, the amount of PB accumulation and the protein content were higher in XM33 than those in NM13. The results revealed that PB distribution varied in different endosperm tissues and that the amount of PB accumulation was remarkably augmented by drought stress.     

饲料CNCPS组分与瘤胃可利用粗蛋白相关性研究

以装有永久性瘤胃瘘管的黄牛作为瘤胃液的供体动物,应用短期人工瘤胃发酵技术和纯化学分析方法,分别测定17种饲料样品的CNCPS组分、体外培养发酵24h的uCP、发酵液的NH3-N浓度和pH值,研究饲料CNCPS组分与uCP的相关性。结果表明,uCP与饲料中的NDF、ADF和CF含量呈负相关关系;uCP与饲料中的CP、EE和NPN含量呈正相关关系;uCP与CNCPS组分中的PA、PB2、PB3、PC呈极显著的正相关关系,与CC、CB2、CA呈极显著的负相关关系;与uCP关系最显著的CNCPS指标为PB3和PB2。     

用康奈尔体系评定饲料营养价值

选取反刍动物常用饲料样品6种,应用康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系(CNCPS)提出的碳水化合物和蛋白质分类方法,分别测定了饲料的粗蛋白(CP)、非蛋白氮(NPN)、可溶性粗蛋白(SCP)、酸性洗涤不溶蛋白(ADIP)、中性洗涤不溶蛋白(NDIP)及酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、木质素和淀粉。并根据康奈尔体系提出的计算方法计算了饲料粗蛋白中的非蛋白氮(PA)、快速降解蛋白质(PB1)、结合蛋白质(PC)、中度降解蛋白质(PB2)、慢速降解蛋白质(PB3)和碳水化合物中的不可利用纤维(CC)、可利用纤维(CB2)、淀粉、果胶(CB1)和糖类(CA)。比较了CNCPS评定饲料营养价值较常规方法的优点,建议建立常规饲料CNCPS评定的数据库,广泛采用CNCPS来评定饲料营养价值。     

网翅蝗科3种蝗虫精子发生时c-kit蛋白特异性表达和比较

以吉林省四平地区网翅蝗科(直翅目：蝗总科)3种优势蝗虫为实验材料，探讨在蝗虫精子发生过程中c-kit蛋白表达和调控机制，应用免疫组织化学和统计分析等方法对精子发生过程中四个代表性阶段c-kit蛋白特异性表达动态进行研究，3种蝗虫分别为：绿牧草蝗Omocestus viridulus (Linnaeus) ，素色异爪蝗Euchorthippus unicolor (Ikonn.)和条纹异爪蝗Euchorthippus vittatus Zheng。结果表明，（1）精原细胞时期阳性表达强度较弱，阳性颗粒细小；（2）初级精母细胞时期阳性表达强度显著增强，阳性颗粒粗大；（3）次级精母细胞时期阳性表达强度继续增强，阳性颗粒细小；（4）成熟精子时期阳性表达强度较强，阳性颗粒细小，并分布于精子头部和尾丝等处；（5）在精巢小管末端发现大量c-kit蛋白成团存在；（6）c-kit蛋白表达存在的种间差异。以上结果提示c-kit蛋白在生精细胞中阶段性的特异表达说明它直接参与和调控精子增殖与分化进程，同时参与成熟精子生理活性维系和受精等功能，甚至还参与调控不同种蝗虫精子发生的进程和种间生殖隔离的维系。     

用净碳水化合物-蛋白质体系评定反刍动物饲料营养价值

分别从西安、上海、杭州、海拉尔和鄂温克等地采集反刍动物常用饲料样品32种,应用康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系（CNCPS）提出的碳水化合物和蛋白质分类方法,分别测定了饲料的粗蛋白质、非蛋白氮（NPN）、可溶性粗蛋白（SCP）、酸性洗涤剂不溶粗蛋白（ADIP）和中性洗涤剂不溶粗蛋白（NDIP）及酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、木质素和淀粉。并根据CNCPS提出的计算方法计算了饲料粗蛋白质中的非蛋白氮（PA）、快速降解蛋白质（PB1）、结合蛋白质（PC）、中度降解蛋白质（PB2）、慢速降解蛋白质（PB3）和碳水化合物中的不可利用纤维（CC）、可利用纤维（CB2）、淀粉、果胶（CB1）和糖类（CA）。比较了CNCPS饲料评定技术与尼龙袋技术的优缺点,建议CNCPS体系可用于反刍动物饲料营养价值的评定。     

禽流感病毒基因组及其编码蛋白的结构与功能

禽流感病毒为单股负链RNA,分为8个独立的节段,分别编码聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)等10种蛋白质,为了深入认识该病毒,对其基因组及各种编码蛋白的结构和功能进行了综述。     

苯巴比妥人工免疫原合成及抗体特性研究

将苯巴比妥(PB)经硝化和还原两步化学修饰后,在其苯环上引入活性基团氨基,合成具有半抗原结构特征的对氨基苯巴比妥(pAPB);用重氮化法将pAPB偶联于栽体蛋白BSA和OVA上,合成人工免疫原BSA-pAPB和包被抗原OVA-pAPB,用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE进行鉴定,推算分子结合比;用BSA-pAPB免疫新西兰白兔和SPF雏鸡,间接ELISA测定多克隆抗体(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性.WestGold层析试验和交叉反应试验鉴定其特异性.结果表明,BSA-pAPB偶联成功,分子结合比为1:19:获得了高价、敏感、特异的pAb,为PB残留免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

不同淀粉含量玉米籽粒淀粉粒度的分布特性

  【目的】 比较不同淀粉含量玉米籽粒淀粉粒度分布特性,及其与籽粒总淀粉、蛋白质含量和容重的相关性。【方法】选用普通型品种农大108、郑单958和高淀粉型品种费玉3号、郑单18,对成熟期玉米籽粒中淀粉粒的体积、数目和表面积分布进行分析测定。【结果】成熟期玉米籽粒胚乳内淀粉粒的粒径分布范围为0.37—31.5μm,以2μm和15μm为界限,将淀粉粒分为小型、中型和大型三类。淀粉粒的体积和表面积分别表现为双峰和三峰分布,淀粉粒的数目表现为单峰分布,其中小淀粉粒组数目占总数的95%左右;高淀粉玉米小淀粉粒组（＜2μm）和中淀粉粒组（2—15μm）所占体积分数显著高于普通型玉米,而在普通型玉米中,大淀粉粒组（＞15μm）所占的数目、体积和表面积百分比相对较高;籽粒总淀粉含量与0.8—2μm,2—10μm和10—15μm的淀粉粒体积百分比均呈正相关,其中与前两者的相关系数达到显著水平,与其它粒径范围的淀粉粒体积百分比呈负相关;蛋白质含量及籽粒容重与所有粒径范围内的淀粉粒体积百分比无明显相关性。【结论】玉米胚乳淀粉粒数目、体积和表面积分别呈单峰、双峰和三峰曲线变化,高淀粉型玉米小、中型淀粉粒组的体积百分比显著高于普通型玉米。