AHL内酯酶在蜡状芽胞杆菌中可增强ZwA抗软腐病作用

双效菌素(Zwittermicin A, ZwA)是一种广谱、新型的抗生素，对很多植物病原菌具有抑制作用；酰基高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)通过降解植物病原菌群体感应（Quorum-Sensing）系统的信号分子，减弱致病基因的表达从而达到抗病的效果。结合这两种物质的不同抗病机理，本研究将来自苏云金芽胞杆菌中的AHL内酯酶基因导入到ZwA产量不同的蜡状芽胞杆菌中，得到相应的重组菌株。实验表明，AHL内酯酶基因在重组菌中可正常表达，并且不影响受体菌ZwA的表达和产量；感病实验证明，同时表达ZwA和AHL内酯酶的重组菌对于胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯所引起的病害的抗病效果比单独含产ZwA或AHL内酯酶的蜡状芽胞杆菌的抗病效果有明显增强。说明结合ZwA和AHL内酯酶的不同抗病机理来提高抗病效果是可行的。     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高双效菌素的抗性

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,zmaR为其抗性基因。在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520菌株ZwA合成基因簇末端存在一个类似ABC transporter的序列(命名为zwa-FEG)。将zwa-FEG基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,大肠杆菌能获得ZwA的抗性;将zwa-FEG转移到产ZwA的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-FEG是一种ZwA专一性的ABC transporter,它能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和ZwA的抗性。     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高对双效菌素的抗性

双效菌素（Zwittermicin A,ZwA）是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,最初是从蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus) UW85中发现的,zmaR为它的抗性基因。在本实验室已测得的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）YBT-1520菌株全基因组序列中有ZwA合成基因簇完整序列,分析发现在其末端存在一个类似ABC transporter的序列（命名为zwa-FEG）。将zwa-EFG在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达,大肠杆菌能获得对ZwA的抗性;将zwa-EFG转移到产ZwA的菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-EFG是一种ZwA专一性的ABC transporter,能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和对ZwA的抗性。     

Bt蛋白在不同矿物上的吸附动力学及其影响因素研究

<正>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)近缘于蜡状芽胞杆菌,革兰氏染色阳性,是一种产生伴孢晶体,能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌。自Vaeck等[1]首次报道转Bt基因抗虫植物以来,从苏云金芽孢杆菌中提取的Bt毒素蛋白被广泛运用于育种实践,这些作物在大田种植过程     

蜡状芽胞杆菌群三大类全基因组序列的同源性分析

全基因组比对一般采用全基因组范围内的序列比对,本文首次采用单基因在全基因组范围内进行基因排列比对,选取了蜡状芽胞杆菌群中的44个必须基因,在该群中3大类共5个(Bt.97-27,Bc.14579,Bc.10987,Bc.E33L和Ba.Ames Ancestor)全基因组进行横向比对,所有基因在各个基因组中的排列顺序完全一致,少有交叉,进一步证明:在蜡状芽胞杆菌群中,特别是在蜡状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌之间,存在相当大的基因相似性,这与前人的研究结果一致。这种相似性有利于将来用于在该群中所有菌株的全基因组测序装配中。     

枯草芽胞杆菌重组木聚糖酶基因高效表达系统的构建

以木聚糖酶基因为研究对象,构建了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从芽胞杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA中分别扩增出完整和不带启动子的木聚糖酶(xynA)基因;利用芽胞杆菌的强启动子,即S-层蛋白的启动子,通过SOE(splicing by overlapping extension)法连接到xynA基因上得到重组基因S-xynA,将xynA和S-xynA分别装载到整合载体pDG1730上,转化α-淀粉酶高产菌株枯草芽胞杆菌B47,将重组基因整合到α-淀粉酶基因上,以期目标基因像淀粉酶基因一样高效表达。结果表明,2个重组菌的产酶活性均得到提高,其中S-层蛋白启动子表达的木聚糖酶活是自身启动子表达的酶活的1.69倍。重组表达的木聚糖酶在pH5~8和40~60℃范围内均具有较高活性。     

苏云金芽胞杆菌N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)在毕赤酵母中的优化表达

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA)编码的N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)能够水解植物病原菌群体效应的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL),进而使革兰氏阴性细菌群体感应受到抑制,减弱病原菌的致病性。本研究将aiiA基因连接至分泌型穿梭表达载体pPICZαB,获得重组表达质粒p PICZαB-aiiA,线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,获得重组工程菌GS115-p PICZαBaiiA。利用定点突变技术,对aiiA基因进行密码子优化,获得重组工程菌GS115-p PICZαB-MaiiA。以终浓度为1%的甲醇、28℃条件下诱导表达,重组工程菌GS115-p PICZαB-aiiA和GS115-p PICZαB-MaiiA均成功表达并分泌出AiiA蛋白。抗病性分析表明,分泌表达的AiiA蛋白能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)的致病性。AiiA蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,拓宽了AiiA蛋白的获取途径,为AiiA蛋白的产业化提供理论依据。密码子优化为今后改造AiiA蛋白,提高AiiA蛋白的表达效率提供了新的思路。     

转防治软腐病基因拟南芥的获得及其抗病性研究

AHLs是细菌群体感应中的关键信号分子,参与包括导致作物软腐病的胡萝卜软腐欧文氏菌在内的许多植物病原菌致病因子的表达。AHL内酯酶能降解AHLs使其达不到临界浓度,从而阻断了病原菌的致病过程。将克隆到的AHL内酯酶基因SS10置于CaMV 35S启动子下构建双元载体,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥。通过抗性筛选和分离比获得纯合转基因植物种子,进行了PCR及RT-PCR鉴定,证明目的基因在转基因拟南芥中整合并表达。初步抗病性实验表明,部分转基因植株具有显著的抗软腐病能力。     

球形芽胞杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和表达

根据S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因核苷酸序列的保守性,利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)基因组中SAMS序列信息设计引物。通过PCR扩增出球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus)SAMS基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-SAM。序列分析表明,来自球形芽胞杆菌的SAMS与大肠杆菌(K02129)、枯草芽胞杆菌(U52812)、酿酒酵母(U17246)、小鼠(J05571)和人(BC018359)的SAMS基因,分别有63.9%、75.4%、58.8%、59.1%和55.7%的同源性。由于一级结构存在明显的差异,将该重组的质粒转入大肠杆菌DH5α并成功地表达了SAMS。通过亲和层析纯化出球形芽胞杆菌的SAMS,SDS-PAGE分析显示蛋白分子量为43kD。HPLC对SAMS的活性分析表明,该酶可催化ATP和蛋氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。     

转N-酰基高丝氨酸内酯酶基因拟南芥的获得及其对软腐病的抗性

N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)是细菌群体感应中的关键信号分子,参与包括导致作物软腐病的胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)在内的许多植物病原菌致病因子的表达.AHL内酯酶能降解AHLs使其达不到临界浓度,从而阻断病原菌的致病过程.将克隆到的AHL内酯酶基因aiiA置于CaMV 35S启动子下构建双元载体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),通过抗性筛选和分离获得纯合转基因拟南芥株系.PCR及RT-PCR分析表明,目的基因在转基因拟南芥中整合并表达.初步抗软腐病实验表明.接种病原菌2 d后,Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28转基因株系的发病率与对照相比显著降低;接种5 d后,Ⅱ 8、Ⅱ 10和Ⅱ28株系的病情指数分别为41.97%、43.53%和45.47%,而野生型达到63.9%.说明aiiA基因在拟南芥中的表达赋予了拟南芥对软腐病的抗性.     

Acylhomoserine lactone production by bacteria associated with cultivated mushrooms

The main bacterial pathogens of cultivated mushroom as well as mushroom-associated bacteria, which were isolated from Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii mushroom niches, were evaluated for the production of N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) by using four bioreporters. Furthermore, identification of AHLs by LC-ESI-FTICR MS was performed on culture filtrates of selected pathogens and mushroom-associated bacteria strains, which resulted in inducing at least one of the four bioreporters. Strains of Burkolderia gladioli pv. agariciola, Pseudomonas agarici and Pseudomonas gingeri, but not those of Pseudomonas tolaasii and Pseudomonas reactans, produced an array of AHLs depending on the strain. This is the first report of AHL production by mushroom bacterial pathogens. Forty-four of 236 bacterial isolates obtained from different niches of cultivated mushrooms, in part identified by the Biolog identification system, were demonstrated to produce AHLs. Among them, seven mushroom-associated bacterial species were for the first time demonstrated to produce the above signal molecules. In the culture filtrates of a certain number of isolates/strains the AHL-hydrolyzed forms were also present. The minimal signal inducing concentration (MSIC) of selected pure AHLs was also determined for the four bioreporters used in this study.     

N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子检测方法的建立

N-酰基-高丝氨酸内酯（AHL）类化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最重要的一类信号分子，并调控许多生理特性的表达。但由于AHLs分子为小分子物质，且AHL产生菌所产生的AHL的浓度极低，因此建立有效检测AHLs方法具有非常重要的意义。本研究利用两种细菌生物感应器Chromobacterium violaceum CVO26和Agrobacterium tumefaciens A136（pCF218/pCF372）建立了琼脂扩散法、薄层层析与细菌生物感应器相结合（TLC-Biosensor）、β-半乳糖苷酶活法等检测AHL的生物学方法,为研究革兰氏阴性菌的群体感应系统提供了有效手段。     

重组H-NS蛋白对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

摘要：胸膜肺炎放线杆菌（APP）是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失。生物被膜在许多细菌的感染与致病过程中起重要作用。我们在筛选APP转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清1型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白（组蛋白样类核结构蛋白）。为了进一步研究H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响,本文以APP血清1型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408bp的hns基因编码区,克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET-hns,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19KDa的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1-0.3μM的rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低,而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4μM对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应。     

克隆包含以拟南芥为寄主的甘蓝黑腐病菌Xcc1067无毒基因的DNA片段

本研究探索了以拟南芥为寄主的甘蓝黑后病菌的致病条件，观察了其病症的发展．建立了菌株Ｘｃｃ１０６７的ｐＩＪ３２００为载体的基因文库，从基因文库中筛选出拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ为寄主的Ｘｃｃ１０６７菌株的无毒基因克隆，该克隆的进一步分析正在进行。     

烟草青枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及生防特性研究

烟草青枯病危害严重,以拮抗菌进行防病的生物防治手段成为研究热点。从不同烟田分离纯化出238株细菌菌株,首先经牙签接种初筛,选取对青枯病菌抑制效果较好的菌株制备其抑菌物质的粗提物,以牛津杯法复筛,最终获得3株对烟草青枯病菌有明显抑制作用的拮抗细菌。全细胞脂肪酸、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明,菌株H19、Y6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株H34为甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。3株拮抗菌经CAS检测平板法和Salkowski比色法,发现均具有产铁载体和吲哚-3-乙酸(IAA)的能力,以菌株H19能力最强。温室促生试验结果表明,3株拮抗菌能显著促进烟草株高、鲜重及干重等指标,与对照相比,平均增长率分别达到70%~115%、40%~49%和32%~42%。温室控病试验结果表明,菌株H19、H34和Y6明显降低烟草青枯病的发病率,防效达76.57%、60.98%和69.83%,稍逊于农用链霉素处理的78.66%。     

Trichoderma–plant–pathogen interactions

Biological control involves the use of beneficial organisms, their genes, and/or products, such as metabolites, that reduce the negative effects of plant pathogens and promote positive responses by the plant. Disease suppression, as mediated by biocontrol agents, is the consequence of the interactions between the plant, pathogens, and the microbial community. Antagonists belonging to the genus Trichoderma are among the most commonly isolated soil fungi. Due to their ability to protect plants and contain pathogen populations under different soil conditions, these fungi have been widely studied and commercially marketed as biopesticides, biofertilizers and soil amendments. Trichoderma spp. also produce numerous biologically active compounds, including cell wall degrading enzymes, and secondary metabolites. Studies of the three-way relationship established with Trichoderma, the plant and the pathogen are aimed at unravelling the mechanisms involved in partner recognition and the cross-talk used to maintain the beneficial association between the fungal antagonist and the plant. Several strategies have been used to identify the molecular factors involved in this complex tripartite interaction including genomics, proteomics and, more recently, metabolomics, in order to enhance our understanding. This review presents recent advances and findings regarding the biocontrol-resulting events that take place during the Trichoderma–plant–pathogen interaction. We focus our attention on the biological aspects of this topic, highlighting the novel findings concerning the role of Trichoderma in disease suppression. A better understanding of these factors is expected to enhance not only the rapid identification of effective strains and their applications but also indicate the potentials for improvement of natural strains of Trichoderma.