利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量

利用冻融法将大豆11S球蛋白GY1基因RNA干扰表达载体转入农杆菌EH105中,以大豆"吉农28"为受体,通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法导入大豆,获得T1代转基因苗12株,并对得到的转基因植株进行分子生物学鉴定。PCR和Southern杂交检测表明,RNAi植物表达载体p3301-Gy1已成功插入到转基因大豆植株的基因组DNA中;RT-PCR和SDS-PAGE检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了作用,11S球蛋白表达含量降低;利用BUCHI N-500型近红外谷物分析仪对转化的大豆蛋白质和脂肪含量进行检测,结果转化植株的籽粒蛋白质含量(36.07%)平均降低1.43个百分点,脂肪含量(21.28%)平均提高0.76个百分点。因此,利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量是可行的。     

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。     

叶酸代谢途径folE基因表达载体的构建及在大豆中的转化

fol E基因是高叶酸调控基因,来源于细菌,已证明在西红柿等植物中,提高了叶酸含量。本试验采用农杆菌介导的大豆子叶节法,将fol E基因在大豆受体材料Williams82中表达。共侵染了200个外植体,得到34株转化苗。通过对转化苗进行除草剂(135 mg·L-1)涂抹鉴定,获得14株除草剂抗性转化苗。PCR检测结果显示其中12株为阳性。Southern杂交结果表明,fol E全长c DNA已成功插入到大豆基因组中,并得到2个单拷贝株系。     

抗虫基因cry1Ab13在大豆中的遗传转化及抗虫性鉴定

cry1Ab13基因是抗虫基因,编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有一定的毒杀作用,构建了植物表达载体pCambia3300-35S-cry1Ab13,通过花粉管通道法将该载体转入大豆品种吉农28中,经PCR扩增检测得到15株T_1代阳性植株。Southern blotting分析显示有5株出现杂交信号,并以单拷贝形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR测定结果表明:cry1Ab13基因在转化植株的叶、茎秆中均有表达,每株表达量各不相同,在叶片部位表达量相对较高,最高为6.7,最低为2.5;在茎部表达量最高为0.76,最低为0.31。对T_1代阳性植株籽粒,采用圆盘分隔法接入大豆食心虫幼虫,进行初步抗虫试验,结果显示转化植株抗虫效果明显,但后代稳定性还需进一步研究。     

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆中表达的初步研究

构建了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，转化大豆，获得转hGM-CSF基因的植株。hGM-CSF的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，该因子末端被加上内质网驻留信号（KDEL），适合在植物中表达。用大豆合丰47的茎尖作为外植体，通过农杆菌介导的转化，获得17株T1转化株。PCR扩增验证转基因植株，检测到11株阳性植株。     

HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化

大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。     

应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体

RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。     

农杆菌介导的大豆植株整体转化

农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径.     

大豆AK基因的克隆与序列多样性分析

基于NCBI网站下载获得的大豆AK基因cDNA序列设计特异引物,以大豆品种东农42总RNA为模板,通过RT-PCR获得约1 690 bp cDNA片段,经序列比对认定为AK基因序列。以19个赖氨酸和蛋氨酸含量特殊的大豆品种为材料,采用相同方法在RNA中进行扩增,并对产物测序,利用软件对所得序列进行分析。结果显示:在不同的大豆品种中AK基因的核酸序列存在两种变异方式,第一种是在336 bp产生1个T碱基突变的基因序列,第二种是在1 369~1 374 bp处出现"CAAGTG"6个碱基插入的序列;在蛋白质水平上,主要是在456~457个氨基酸处存在A和S两个氨基酸插入突变。AK基因结构完整,其编码的蛋白产物具有AA_kinase、Carbamate kinase-like、Aspartate kinase和ACT保守结构域。本研究首次对大豆中AK基因多样性进行了分析,为大豆天冬氨酸代谢途径其它相关酶基因的研究提供了理论依据,也为大豆AK基因在植物基因工程等领域的研究和应用奠定了良好的基础。     

大豆胰蛋白酶抑制剂与大豆抗大豆胞囊线虫的关系

对大豆胞囊线虫3号小种的抗病品种Hartwig和小粒黑豆,感病品种辽豆15和中黄28分别接种线虫,检测大豆根系中大豆胰蛋白酶抑制剂的表达量对大豆抗胞囊线虫的抗性.经过胰蛋白酶抑制剂活性测定结果表明,接种大豆胞囊线虫的抗感品种的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)表达量明显高于未接种的品种,各个品种的STI表达量也不同.说明大豆胰蛋白酶抑制剂参与抗病过程.但是各个品种的变化趋势并不相同,表明抵御线虫的抗病作用机制存在品种间差异.     

发展套作大豆,振兴大豆产业

中国大豆供求失衡,振兴大豆产业势在必行.北方大豆正面临单位土地产出率低带来的比较效益低下、产销分离引起的成本增加、大面积重迎茬种植带来的减产严重、油酯和蛋白质含量不高等不利因素,限制了进一步发展.套作大豆作为南方新型旱地多熟种植模式的主体作物,具有与主要粮食作物和谐共存,蛋白质含量高、利于食用和加工业的发展,减轻季节性干旱的危害、实现抗旱增收等优点,发展潜力巨大.作者认为稳定北方大豆面积,提高单产,大力发展南方套作大豆是振兴我国大豆产业的必然之路.     

新育成大豆品种对SMV和SCN的抗性评价

在接种我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3及SC-7和SCN 1号生理小种的条件下,对新育成的参加2004～2007年围家及江苏、北京、山东等省市大豆区试的品种分别进行了抗性评价.结果表明:在抗SMV鉴定的334个品种中,对SC-3抗性较好(高抗和抗病)的品种数有148个,占参试品种数的44.31%;对SC-7抗性较好的有71个,占参试品种数的21.26%.同时对2个株系抗性表现较好的有55个,占参试品种数的16.47%.这些抗性较好的品种既町用于大豆生产,也可作为抗源用于抗病品种选育和与抗性相关的研究.研究还显示,来自于西北和黄淮海大豆产区的参试品种一般抗性较好.抗SCN鉴定的193个大豆品种中,未发现高抗品种,中抗品种有25个,占12.92%.汾9877.10、邯601、蒙9793-1、沧豆九号等7个品种兼抗sMV和scN 2种病害.     

微波辅助提取豆粕中大豆异黄酮

采用微波辅助提取豆粕中大豆异黄酮,通过单因素实验和正交实验研究了微波火力、乙醇浓度、料液比、微波时间对大豆异黄酮提取率的影响.结果表明,在试验条件范围内各因素对大豆异黄酮提取率的影响主次顺序为:微波火力＞乙醇浓度＞料液比＞微波时间.微波辅助提取大豆异黄酮的最佳条件为:料液比1∶20(g∶mL),微波火力中高火,微波时间3 min,乙醇浓度50％.在此条件下,大豆异黄酮的提取率可达到1.2432％.     

大豆纤维

本世纪30年代以来，营养科学技术的发展使人们对于食物成分的了解日益深入，膳食组成的粗与精对人体健康的利与弊一直是一个科学家们争论不休的问题。70年代初，英国医生贝尔克特等人在非洲进行流行病学调查时，发现西方发达国家发病较多的某些慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、结肠癌等，在非洲农村地区却极为少见，研究认为这是由于西方国家饮食过精而缺少膳食纤维的缘故，并将这些疾病称为“文明病”。1974年他们将调查结果以题为膳食纤维与疾病”的论文发表在《美国医学杂志》上，提出了膳食纤维的缺乏与某些慢性疾病的发生有相互关系的明确论述。自此以后，膳食纤维开始受到各国学者的重视。美国膳食纤维专家斯佩勒博士在文章中写道：“膳食纤维已由60年代其价值被埋没的营养素而变成70年代末的重要膳食组成部分”。现今几乎所有营养学家都承认，食入适量的膳食纤维，将无疑会增进人民的身体健康。     

大豆皂甙

吃过生大豆的人都会有这种体会，那就是口感上有一种淡淡的苦涩味，但究竟这是为什么，过去谁也说不清楚。如今，当科学家把这种物质从大豆中提取出来并进行科学实验、并公开研究成果后，人们才恍然大悟，原来这种被称作大豆抗营养因子的天然物质，叫大豆皂甙，是对人体有诸多好处的保健功能因子。     

大豆甾醇

大豆甾醇之所以被誉为“生命的钥匙”，是因为大豆甾醇广泛存在于生物体组织内，具有十分重要的生理功能。很自然地，对甾体科学的研究就成为医学界和制药工业中引人瞩目的领域，其实在化学工业、食品、饲料和生物工程产业中，大豆甾醇也备受国内外科学家的关注，对大豆甾醇的研究和应用目前相当活跃。说起大豆甾醇，有必要先从甾醇谈起，甾醇是甾族化合物的一类，因呈固态又俗称固醇。甾醇的分布很广，各种生物体中几乎都含有这一类甾族化合物。它们以游离、高级脂肪酸酯、苷三种形式存在于动、植物和微生物体内。     

大豆根瘤菌与大豆品种共生匹配性研究

大豆与大豆根瘤菌的共生体系是共生固氮的代表,开展根瘤菌与大豆品种的匹配性组合研究,为发挥这一共生体系的固氮效率和指导大豆育种材料的选择等方面均具有重要的实践价值。选取不同种类与来源的大豆根瘤菌代表菌株18株,与11个我国主要的大豆核心种质品种进行共生匹配性试验,测定了其中5个大豆品种与14个根瘤菌所结瘤的固氮酶活性并进行统计分析。结果表明：不同的大豆根瘤菌菌株间存在明显的结瘤固氮差异,快生大豆根瘤菌表现出比慢生根瘤菌更严格的大豆品种匹配性;其中USDA110、USDA110-A、113-2、WHG12、HH103、B16比其他供试菌株表现出广谱的结瘤特性,且USDA110、USDA110-A、113-2、WHG12、DE333、2048菌株形成的根瘤具有较高的固氮酶活性。在供试大豆品种中,商951099、郑92116和北京黑豆表现出较高的结瘤、固氮特性;商951099和郑92116这对材料与所供试18株大豆根瘤菌均结瘤且差异性不明显,而绥农14和绥农20、合丰25和固新野生大豆这两对材料表现出明显结瘤差异性。因此,实践中应根据大豆品种和大豆根瘤菌菌株的匹配性关系,选用共生效果好的菌株接种,或选用与之匹配的大豆种质材料育种,以达到提高共生固氮功效的目的。     

低温豆粕中大豆皂甙的微波提取工艺优化

为优化提取和纯化低温豆粕中皂甙的加工工艺,采用微波法提取低温豆粕中的大豆皂甙,通过单因素试验和正交试验研究了微波火力、乙醇浓度、料液比、微波时间对大豆皂甙提取率的影响.结果表明:在试验条件范围内各因素对大豆皂甙提取率影响的主次顺序为微波时间＞微波火力＞乙醇浓度＞料液比;在微波火力为中高火、微波时间2.5 min、乙醇浓度60％、料液比1:25(g:mL)的条件下得到最优工艺条件,此时大豆皂甙的提取率为0.640％.     

豆渣中水溶性大豆多糖的提取工艺研究

大豆多糖是大豆中的有效活性成分之一,具有抗氧化性、食品稳定性等作用.以市售豆渣为材料,采用不同的提取温度、液固比和提取时间进行单因素试验,然后在此基础上采用三因素三水平的正交试验对水溶性大豆多糖的提取条件进行优化.结果表明:提取温度对水溶性大豆多糖提取率的影响最大,其次是液固比,再次是提取时间.水溶性大豆多糖提取的最优工艺参数是:提取温度为90℃、液固比为5:1、提取时间为3 h.经苯酚-硫酸法测定,水溶性大豆多糖含量为7.47%(以葡萄糖计).