大豆查尔酮还原酶基因GmCHR的克隆与植物表达载体构建

黄酮类化合物在植物中参与过滤紫外线、固氮和花色形成等过程,异黄酮对人体有抗氧化、预防乳腺癌等保健作用。查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)是植物中参与黄酮类化合物代谢的重要酶。克隆大豆查尔酮还原酶基因并构建植物表达载体,有助于进一步研究其功能和异黄酮的代谢过程。采用RT-PCR方法,从栽培大豆(Gly-cine max)南农1138-2中,克隆得到了第14号染色体上的一个编码大豆查尔酮还原酶(chalcone reductase,CHR)的基因,命名为GmCHR。该基因含有948 bp长的编码区序列(Coding DNA Sequence,CDS),编码315个氨基酸。预测其蛋白质分子量为35.5 kDa,等电点为6.32。与其他豆科植物中的查尔酮还原酶相比,GmCHR蛋白序列与葛藤(Puerari-ae montana)CHR的相似性最高,达94%。组织表达分析表明,在自然生长条件下GmCHR在叶中的表达量最大;其次是种子;在花和茎中相同;在根中的表达量最小。利用Gateway方法获得植物过表达载体pMDC83-GmCHR,经检测表明过表达载体已成功转化农杆菌EHA105,为今后进一步了解GmCHR在大豆异黄酮代谢过程中的功能提供材料基础。     

不同生育时期大豆异黄酮合成相关酶基因表达的分析

通过Real-time PCR分析了不同生育时期7个大豆异黄酮合成相关酶基因(PAL,C4H,4CL,CHS,CHI,IFS和F3H)的相对表达情况.并利用高效液相色谱法测定了籽粒发育过程中豆荚(含籽粒)中异黄酮及其组分的含量,同时利用SAS8.2分析了F5∶11重组自交系群体(RILs)豆荚中异黄酮含量与部分基因相对表达量间的相关性.结果表明:从营养生长进入生殖生长阶段,部分基因(PAL,CHI,IFS和F3H)的相对表达量普遍有显著提高;PAL,C4H,CHS和IFS基因在叶片中的相对表达量高峰出现在R1期,大部分基因在2个品种豆荚中相对表达量差异显著的时期为R6期.在R6期,豆荚中PAL基因的相对表达量与染料木素(GT)和总异黄酮含量(TI)呈显著正相关.CHS基因的相对表达量与大豆黄素(DZ)、染料木素(GT)和总异黄酮含量(TI)呈显著正相关,但是与黄豆黄素(GC)呈显著负相关,IFS基因的相对表达量与大豆黄素(DZ)含量呈显著正相关;F3H基因的相对表达量与所有异黄酮成分均呈显著负相关.研究明确了相应基因的表达情况,对于理解异黄酮含量变异的遗传机制具有重要意义.     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

大豆核孔蛋白GmNup96基因的克隆及生物信息学分析

从大豆品种天隆1号的叶片中克隆Gm Nup96基因的c DNA序列,对其编码的氨基酸序列、蛋白质理化性质、一级结构、二级结构、亚细胞定位等进行了生物信息学分析。结果表明:Gm Nup96基因编码1 022个氨基酸,为具有一定亲水能力的酸性蛋白,不具有信号肽,相对分子量为116.199 7 k Da;二级结构预测结果显示,Gm Nup96序列存在α-螺旋(46.87%)、无规则卷曲(26.32%)、延伸链(17.03%)和β-转角(9.78%),并无其它二级结构;系统进化树分析表明,大豆Gm Nup96基因与野生大豆、芸豆、绿豆、红小豆之间的亲缘关系更近。     

大豆异黄酮的研究开发与利用

近年来,西方膳食结构引起的肿瘤、心脑血管等疾病越来越受到关注,研究表明,膳食大豆异黄酮与癌症和冠心病的发病率密切相关,染料木素(Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ,Ｇ)和大豆甙元(Ｄａｉｄｚｉｅｉｎ,Ｄ),作为大豆异黄酮甙元成分,具有多种生理作用,应用价值很高。一、大豆异黄酮的来源、分布、组成及其影响因素大豆异黄酮主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中,种皮含量极少。80%～90%异黄酮存在于子叶中,浓度约为01%～03%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高,约为1%～2%,但由于胚只占种子总重量的2%,因此尽管浓度很高,所占比例却很少(10%～20%)。目前…     

大豆异黄酮的品种间差异分析

直接使用乙醇分离提取大豆异黄酮,并用高效液相色谱技术对8个大豆品种中大豆异黄酮含量进行了品种间差异分析,并对5种异黄酮组分（染料木素、黄豆黄甙、大豆甙、大豆甙元、染料木甙）进行了定量分析。发现品种间的大豆异黄酮和各组分的含量差异显著,黄皮豆的异黄酮含量明显高于其他品种,吉农17异黄酮含量最高,其含量可达6．6‰。     

大豆HB基因GmSbh1的分离与生物信息学分析

从大豆叶片中分离到Gm Sbh1基因c DNA的完整开放阅读框(ORF)序列,对其编码的氨基酸序列、蛋白质一级、二级结构及互作蛋白等进行了生物信息学分析。结果表明:在Gm Sbh1基因c DNA序列的第156~1 293 bp处有一个完整的ORF,编码379个氨基酸;Gm Sbh1具有同源异型盒(homeoboxbox,HB)基因家族典型的KNOX1、KNOX2、ELK和Homeodomain(HD)结构域;检索到18条与Gm Sbh1核酸序列一致性大于80%的序列;Gm SBH1为亲水性蛋白,不具有信号肽,分子量为42.37 k Da,其中丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asn)和亮氨酸(Leu)分别为占10%、9.8%和8.4%,可能发生磷酸化的位点分别在Ser(13个)、酪氨酸(Tyr)(2个)和苏氨酸(Thr)(1个)上;二级结构预测结果显示,Gm SBH1序列存在α-螺旋(占39.31%)、β-转角(占5.28%)、延伸链(占8.44%)和无规则卷曲(占46.97%),不存在跨膜螺旋;蛋白互作预测表明,Gm SBH1与拟南芥中的RPL、BEL1、AT4G32980.1-P、BLH2和BLH3等蛋白的互作程度较高,其中与BEL1共表达的几率较高。     

大豆叶片异黄酮含量与PAL基因相对表达量的关系

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙氨酸代谢途径的进入点酶,也是异黄酮合成的关键酶之一.为了分析大豆叶片中异黄酮含量与苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因表达量的关系,采用砂培试验,测定了不同生育时期大豆叶片总异黄酮及大豆黄素、黄豆黄素、染料木素的含量,同时测定了相应各生育时期大豆叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的相对表达量.结果表明:大豆叶片中大豆异黄酮总含量及3种苷元组份含量与叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)基冈的相对表达量有一个协同增减的趋势;在初花期(R1)大豆叶片中的异黄酮总含量和三种苷元组份含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因相对表达量均出现一个峰值.     

储藏温度与时间对大豆子粒中异黄酮含量的影响

以异黄酮含量显著不同的6个大豆品种为材料,采用高效液相色谱(HPLC)技术研究三种储藏温度(室温、4℃和-10℃)条件下不同储藏时间对大豆异黄酮含量的影响.结果显示,不同大豆种子随着储藏时间的增加异黄酮含量逐渐降低,储藏一年后平均降低57.1%,以丙二酰基异黄酮组分降低为主,且达显著水平.储藏温度对大豆种子中异黄酮含量的影响不显著.常温下储藏的大豆种子异黄酮含量有偏高的趋势,且不同品种的表现有所不同.     

IFS转基因大豆的鉴定及高异黄酮植株的筛选

大豆异黄酮是一种广泛应用的保健性活性物质,近年来已成为衡量大豆品质的重要指标之一。异黄酮合酶是大豆异黄酮合成途径中的关键酶基因之一,其在植物中的表达效率直接影响异黄酮含量。为进一步验证该基因的功能并获得高异黄酮稳定遗传转基因植株,本试验基于已有的IFS转基因材料开展研究。将其扩繁至T2代,考种分析植株农艺性状,发现转基因植株的性状指标未发生明显变化,PCR鉴定IFS转基因后代的结果显示:在125株转基因植株中,60株为阳性,占比48%,说明IFS在后代中可稳定遗传。选取IFS转基因吉林35、Willimas 82品种T2代的41株,利用改良后的三波长法测定籽粒中大豆异黄酮的含量,结果显示:IFS转基因植株的平均异黄酮含量为1.2 mg·g~(-1);其中15株的异黄酮含量高于非转基因植株,占比达到36.6%,说明从转入IFS基因转基因大豆能够筛选出高异黄酮植株。本研究获得了稳定遗传的高异黄酮植株,为大豆遗传育种提供优异的种质资源;改良后的三波长法较原有方法更为精准、快速。     

黑龙江省野生大豆高异黄酮新种质创新利用Ⅰ异黄酮含量及与籽粒相关性状的分析

通过采用高效液相色谱法对黑龙江省247份野生和栽培大豆异黄酮含量的分析以及大豆异黄酮含量和籽粒相关性状的分析,初步明确了：野生大豆异黄酮含量的分布范围（416．2～6808．2μg／mL）;野生大豆异黄酮平均含量高于栽培大豆;大豆籽粒中异黄酮含量和籽粒大小呈显著负相关（r=-0．9648^＊＊）;大豆籽粒中异黄酮含量和籽粒颜色也具有相关性。     

高纯度大豆黄苷及大豆黄素的制备

使用不同的溶剂从大豆异黄酮粗品中提取大豆黄苷.通过溶剂回流萃取及不同溶剂组合萃取实验确定了最佳的提取条件.结果表明,丙酮和乙酸乙酯的组合萃取可以将原料中大豆黄苷的含量提高2.5倍以上.最终可以得到纯度为90%的大豆黄苷产品,收率40%.产品再通过盐酸水解可以得到其相应甙元.     

大豆异黄酮的生理功能研究进展

大豆异黄酮是大豆中的一类具有广泛营养学价值和健康保护作用的多酚化合物,引起了国内外学者的广泛关注.研究表明,大豆异黄酮作为一种植物性雌激素,具有类雌激素和抗雌激素双重作用,并且在抗肿瘤、预防绝经期妇女骨质疏松症以及预防心血管疾病等方面的作用也得到了流行病学和实验数据的有力支持.本文对近年来国内外大豆异黄酮的生理功能的相关研究报道进行了分析整理,同时对大豆异黄酮的结构、代谢以及发展前景做了介绍.     

大豆异黄酮提取技术研究

大豆异黄酮是一类从大豆中分离提取出的具有多酚结构的混合物,研究表明:大豆异黄酮可以对抗超氧阴离子自由基,具有抗氧化作用;它具有一般意义上抗肿瘤、预防骨质疏松、缓解更年期综合症、预防心脑血管疾病等作用。随着人们对大豆异黄酮生理活性的深入研究,大豆异黄酮的需求量日益加大,本文介绍了现阶段国内外在大豆异黄酮提取方向的研究进展,希望为我国大豆异黄酮提取工业化、规模化生产提供一些思路。     

不同纬度地点大豆子粒异黄酮含量差异

采用不同纬度的田间试验，对大豆异黄酮及其三种苷元含量的影响效应进行了研究。试验结果表明，环境条件的变化及品种对大豆异黄酮及其三种苷元的含量有极显著影响；除黄豆黄素以地点效应最大外，大豆黄素、染料木黄素及总含量均以基因型×地点互作影响效应最大，4种含量基因型影响最小。在黑龙江省范围内，大豆子粒异黄酮总含量及其三种组分含量均与纬度呈不同程度的正相关。     

地理环境对大豆种子中异黄酮积累的影响趋势

以７个异黄酮含量显著不同的大豆品种或品系分别在７个地区种植，利用ＨＰＬＣ技术分析所收种子中的异黄酮含量。以期获得种子中的异黄酮积累与地理环境之间的相互关系。结果显示，在７个地区中各品种异黄酮平均含量显著不同，山西最高（２４９２．３μｇ／ｇ），湖北最低（７６３．４μｇ／ｇ）。同一品种在不同地区其变异系数也不同，吉林３号变异系数最高（４９．４％）；张家口黑豆最低（３３．５％）。７个大豆品种异黄酮含量与纬度和海拔高度呈正相关，与经度呈负相关，且与纬度的相关程度最高，均达到显著或极显著水平，与经度和海拔高度的相关程度相对较低。另外，各品种与各地区的平均气温和降水量呈负相关，与日照时数呈正相关，且与平均气温的相关程度最高（ｒ＝－０．８７９＊＊）     

高效液相色谱(HPLC)技术检测大豆异黄酮含量

利用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）技术分离并测定了大豆中异黄酮各组分含量，建立了快速、有效的分离、检测异黄酮含量的方法。结果显示，异黄酮的最适提取时间是２－３ｈｒ；最适检测波长为２６０ｎｍ；在一定的浓度范围内，标准样品Ｄａｉｄｚｉｎ和Ｇｅｎｉｓｔｉｎ作为异黄酮的检测标准是准确的；提取和检测温度对异黄酮组合含量有很大影响，在８０℃或更高的温度条件下，丙二酰基结合体可水解为相应的甙或甙元的形式。     

高异黄酮含量大豆新品种中豆27

大豆新品种中豆27（原名中作91K12）是中国农业科学院作物育种栽培研究所利用高产，抗花叶病毒病品种中豆19号作母本，美国引进材料威廉姆斯（Williams)的近等基因系P.I.L81-4590作父本进行有性杂交，采用高效液相色谱（HPLC）技术，对杂种后代的异黄酮含量进行检测及多年辅助选择育成，其突出特点为抗癌物质（异黄酮）含量高，高产，优质（蛋白质，脂肪双高），抗病，综合性状优异，并对中豆27的栽培技术进行了探讨。     

吉林省普通大豆品种(系)异黄酮含量分析

利用超声波法对吉林省26份普通大豆品种(系)大豆异黄酮含量进行HPLC测定.建立了一种HPLC测定大豆籽粒中异黄酮含量的方法.结果表明:异黄酮各异构体在50～1000μmol·L~(-1)范围内线性系数良好,相关系数为0.9998～0.9999;检出限为1.09～2.06 mg·L~(-1),定量限为3.25～6.46 mg·L~(-1);异黄酮各异构体同收率为97.11%～103.31%;相对标准偏差(RSD,n=7)分别为2.03%～4.32%.该方法线性范围广,线性关系好,灵敏度和准确度高,适合于大豆及大豆制品中异黄酮含量的测定.测得吉林省261份普通大豆品种(系)中的异黄酮含量范围1.46～4.97 mg·g~(-1),超过4 mg·g~(-1)的品种(系)有23个,占测定品种(系)总数的8.81%.     

大豆子粒中异黄酮含量的快速测定

建立了一个快速测定大豆异黄酮含量的方法,并用该法测定了来自东北三省的50份大豆材料子粒中的异黄酮含量.该体系的最佳提取条件为:不脱脂,80%的乙醇浓度,不小于20:1的物料比(溶剂:原料),浸提1小时,浸提温度不超过50℃.东北三省的50份大豆材料异黄酮含量的平均数为0.285%,品种间变异幅度为0.194%-0.408%,主要分布于0.235%到0.295%之间,其品种数占全部品种数的56%.