通过精液移植构建中国明对虾家系及微卫星分型鉴定父本

本研究首次采用精液移植法进行中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的家系构建,利用10尾已交尾雌虾纳精囊内精液对17尾未交尾雌虾进行了移植,共建立11个中国明对虾家系,其中含有父系半同胞家系2个;精液移植的平均受精率为46.8%,最高受精率为78%,授精成功率为64.7%。为了揭示每个家系母本内精液的来源情况,选用6个中国明对虾微卫星标记对11个家系的母本、母本内精液及每个家系的6个个体进行分析,推算出每个家系各自的父本基因型,并与各自母本内精液基因型进行比较,成功地对11个家系进行了父本鉴定。实验结果表明,11个家系的父本基因型与各自母本内精液基因型相同,每个家系内个体属全同胞关系,即对于1尾自然交尾雌虾,其纳精囊内精液只来自于1尾雄虾。通过本实验,验证了精液移植在构建中国明对虾全同胞家系和半同胞家系中的可行性,阐明了精液移植家系内个体的亲缘关系,为中国明对虾选育工作提供了技术保证。     

中国对虾微卫星引物筛选及反应条件优化

对33对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物进行筛选,确定了其中11对引物的最优PCR反应条件,包括各对引物的退火温度、反应体系中引物、Mg2 、dNTPs含量等,为建立微卫星多重PCR技术、最终使微卫星标记成为中国对虾家系识别的有效工具奠定了基础。     

水温对中国对虾交尾的影响

关于中国对虾(Penaeus orientalis)交尾的生物学问题,以往有过不少报导。高洪绪(1980)曾对中国对虾的交尾过程作过较细致的描述;纪成林(1980)从中国对虾生命周期中蜕皮性质划分的角度论述了生殖蜕皮的大致规律。此外,Possano(1960)证明温度是甲壳类蜕皮的主要因子。而对于温度与中国对虾交尾之间的关系问题,尚未见正式报导,为此,我们于1986年11月2日至12月1日,进行了中国对虾交尾的温度梯度实验,现将结果报     

中国对虾微卫星DNA引物的设计及筛选

根据建立的中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)部分基因组文库,对筛选的含微卫星DNA序列的克隆设计了28对引物,筛选出5对微卫星多态性引物,并用这5对引物对中国对虾的养殖群体20个个体进行了遗传多样性分析。在这5个微卫星位点中,虽然．RS0871位点是多态位点,但其等位基因数、杂合度和多态信息含量都比较低。其余4个微卫星位点可产生6～8个等位基因,等位基因的大小分布在142～364bp,基本上符合引物设计时理论产物长度。这些微卫星位点的期望杂合度的范围为0．7577～0．8064,表明它们都有较高的杂合度。仅有位点RS0956的观察杂合度与期望值有较大的出入,其他微卫星位点的这两值基本相符。有4个微卫星位点的PIC值较高,在0．7180～0．7709。因此,除RS0871位点以外的4个微卫星位点均可用于中国对虾种群遗传结构分析,这将为中国对虾品种选育、种系评估提供更多的微卫星DNA信息。     

微卫星DNA技术用于中国对虾家系构建中的系谱认证

用6个微卫星标记对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的5个家系进行系谱鉴别和遗传多样性研究。6个微卫星位点中有5个位点是多态的，并在所有家系中都显示了高度的遗传差异。5个家系中，5个多态微卫星位点共发现了30个等位基因，每个位点的等位基因数在5～8之间。实验中共发现了4个家系特异性等位基因：2^#家系及4^#家系各1个，5^#家系2个。根据已知亲本及子代基因型，可推断出5个家系中全部亲本的基因型，据此鉴别各家系。在EN0033位点，可将5#家系与其他4个家系相区别；在RS0859位点，可将3^#和4^#家系与其他3个家系相区分。因此，EN0033和RS0859标记可用于鉴别5^#、3^#和4^#家系的家系特异性标记。研究表明，用5个微卫星标记，且最少用2对微卫星标记即可鉴别5个中国对虾家系。     

从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究

利用生物信息学方法在含有10446个中国对虾ESTs的数据库中进行微卫星序列的筛选，共发现微卫星序列229个，占整个ESTs数据库的2．19％，其中含双碱基重复序列146个和3碱基重复序列58个，分别占在ESTs数据库中发现微卫星序列总数的63．76％，和25．33％，大部分发现的微卫星序列均为Perfect形式的重复序列。根据筛选得到的微卫星序列设计并合成引物19对进行多态性检测，在有扩增产物的16对引物中，首次筛选得到8个中国对虾微卫星标记，并对这些微卫星标记进行了等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等统计学指标的评价。结果表明，在8个微卫星位点上，等位基因的数目从5到15不等，等位基因长度从：165～305bp，期望杂合度和多态性信息含量分别为0．59到0．89和0．56到0．88，表明这8个中国对虾微卫星标记完全适合于遗传分析。     

微卫星DNA标记用于中国对虾亲子关系的鉴定

在水产养殖中应用微卫星标记来确定亲缘关系已经得到认同和广泛使用。本研究通过控制交尾,利用微卫星标记确定中国对虾后代的亲缘关系,对微卫星标记应用于中国对虾的家系识别进行初步探讨。作者以4个谱系清晰的家系为基础,检测两对微卫星标记EN0033和RS062在中国对虾家系鉴别中的应用。结果表明,利用两对微卫星引物产生的DNA指纹图谱,能够有效地区分中国对虾4个家系。根据微卫星数据计算各家系之间的遗传距离,构建UPGMA图,得到的结果与各家系来源情况一致,进一步证明了微卫星技术在进行家系间的遗传分析中的可行性。EN0033和RS062两对微卫星标记的累积个体识别率高达0.989,属于高识别力的遗传标记系统,可以利用它们进行中国对虾的亲缘关系鉴定。     

斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究

采用(CA)_(12)(AG)_(12)及(TA)_(16)生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选,得到51个候选克隆(20．1%)。其中,32个克隆来源于CA-文库,另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元,通过序列比对,最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)_N及(CA/GT)_n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20．7%及60．4%。此外,还检测到其它多种微卫星重复类型,如(AT)_n、(GC)_n、(TGG)_n、(AAG)_n、(AAT)_n、(GAA)_n、(GTGC)_n、(GCGT)_n、(GGTTA)_n、(GTGCGT)_n,占检测到的微卫星数目的18．9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68．5%),不完全型序列的有22条(19．8%),另有13条属于复合型序列(11．7%)。微卫星(GT/CA)_n 2碱基重复次数(3～52次)要远大于(GA/CT)_n 2碱基次数(3～27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129～601 bp,平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

用PCR法快速筛选中国对虾含微卫星的重组阳性克隆

运用PCR在中国对虾的小片段基因组文库中快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆。PCR中使用的引物为载体pGEM-3(zf( )上多克隆位点两侧的T7／Sp6启动子引物和根据微卫星核心重复序列设计的STR引物：STR1：5‘-ATATATATATAT－3‘：STR2：5’－TCTCTCTCTCTC－3’，直接使用含有重组克隆的菌液，在PCR反应前增加一段裂解细菌的高温。筛选出来的含有微卫星序列的重组阳性克隆经DNA测序验证。结果证明，采用PCR方法用菌液快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆完全可行，而且具有简便、快速、高效、不涉及同位素操作等优点。     

微卫星技术对黄、渤海海域7个不同地理群体中国对虾的遗传结构和遗传分化研究

采用微卫星DNA技术对黄、渤海海域7个不同地理群体的中国对虾进行了遗传结构和遗传分化研究.7个地理群体分别来自辽东湾(LD)、渤海湾(BH)、海州湾 (HZ)、乳山湾 (RS)、海洋岛 (HYD)、朝鲜半岛西海岸(KW)以及朝鲜半岛南海岸(KS).7对多态性良好的微卫星引物共检测到109个等位基因,群体平均期望杂合度(He)范围为0.810～0.864.49个群体位点中,只有15个符合Hardy-Weinberg平衡.UPGMA聚类分析显示,各地理群体亲缘关系与地理位置关系密切.根据各地理群体间遗传距离及AMOVA遗传分化检验结果,可将中国对虾分为3个独立种群,分别为中国沿岸黄、渤海群体、朝鲜半岛西海岸群体及朝鲜半岛南海群体;其中中国沿岸黄、渤海群体内部也发生了一定程度的遗传分化,但是否达到种群水平还有待于进一步验证.     

微卫星三重PCR基因扫描技术在中国明对虾家系标识中的应用

在开发中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)微卫星引物的基础上,利用3对微卫星引物,克隆编号分别为H081、RS0683和RS1101,构建中国明对虾的三重PCR稳定扩增体系。在此基础上,进一步利用荧光标记引物的基因扫描技术(Genescan)对利用精荚移植技术建立的中国明对虾7个半同胞家系和16个全同胞家系进行识别研究。结果表明,该项技术可以准确地把7个半同胞家系的子代个体间、16个全同胞家系的子代个体间以及总的31个全同胞家系的子代个体间区别开,且能准确把这些家系产生的任意子代个体定位到各个家系。该技术可以满足大批量家系材料样本的分析,具有较好的应用价值。[中国水产科学,2007,14(1):59-66]     

定向交尾技术在中国对虾家系构建中的初步研究

为满足中国对虾家系选育中所需的家系材料,本研究在2004年进行了中国对虾室外和室内定向交尾实验。室外定向交尾实验采用3个不同地理群体的中国对虾,设计了5个交配组合,1尾雄虾搭配4尾雌虾,自然温度下让亲虾交尾,获得了5%的平均交尾率;室内定向交尾实验通过控制水温和密度,促使中国对虾交尾,获得了16.9%的平均交尾率。其中,室内交尾的温度实验设计了12、14、16、18℃4个梯度,雌、雄性别比例均为4∶1,x2检验分析表明,4个温度梯度的交尾率存在差异,其中14℃平均交尾率最高,为31.3%,12℃平均交尾率最低,为6.3%。实验结果表明,室外定向交尾的影响因素较多,不容易控制,很难满足建立大量家系的需要;室内定向交尾在14~16℃的水温条件下,采用雌、雄性别比例为4∶1,可获得较好的交尾效果。本实验结果为大规模建立中国对虾全同胞和半同胞家系奠定了基础,为中国对虾进一步育种工作提供了依据。     

中国对虾人工选育群体的同工酶分析

采用水平淀粉凝胶电泳技术对中国对虾人工选育子一代、子四代、子五代群体和黄、渤海野生群体遗传变异进行了同工酶比较分析。结果表明，在检测的4个群体肌肉组织的13个基因位点中，MDH-2^*、GPI^*、MPI^*、PGM-2^*和PGM-3^*5个位点呈多态。PGM-3^*位点上的变异程度最高，其等位基因频率呈递减趋势；人工选育群体在MPI^*位点上出现^*c基因，其等位基因频率呈递增趋势。中国对虾野生群体同人工选育群体的多态位点比例相同，为38．46％；其平均观察杂合度分别为0．0577、0．0377、0．0263、0．0231，呈依次递减趋势。中国对虾野生群体和人工选育群体之间的遗传距离平均值为0．0062，远大于子四代和子五代间的遗传距离。人工选育中国对虾群体的遗传多样性已有所降低，但在某些基因座位上出现了特异基因，这是否可作为具有良好生长特性和抗逆能力的人工定向选育群体的基因标记尚有待进一步研究。     

磺胺甲基异(口恶)唑在中国明对虾体内的药代动力学研究

采用高效液相色谱法为定性、定量手段,研究了19℃下单次肌注给药后磺胺甲基异(口恶)唑在健康中国明对虾体内的代谢规律。给药后血淋巴内的药物浓度即达到峰值,此后迅速下降;肝胰腺内药物浓度较低,给药2小时后达到最高浓度(4.97μg/ml),此后迅速下降,至48小时不能检出。采用MCP-KP自动化药动学分析程序对数据进行分析,结果表明,中国明对虾单次肌肉注射磺胺甲基异曝唑后(50mg/kg),血药经时过程符合一级吸收二室开放模型。主要动力学参数如下:吸收半衰期(t1/2α)为0.41小时,消除半衰期(t1/2β)为10.87小时,药时曲线下面积(AUC)为64.51mg/L.小时,表观分布容积(vd)为12.21L/kg,总体清除率(CL)为780.05ml/kg/小时。结果表明,磺胺甲基异(口哑)唑在中国明对虾体内分布较广、代谢较快。