牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

通用真核表达载体的构建及其活性检测

以质粒 pc DNA3和 p SV2 -dhfr为基础 ,构建了 2个通用表达载体 p MCD-A和 p MCD-B,然后将 EPOminigene克隆于它们的多克隆位点之中 ,得到表达载体 p AE和 p BE,经脂质体导入 CHO-dhfr- 细胞瞬时表达 ,结果表明 ,p MCD-A和 p MCD-B表达效果较好 ,表达产物经网织红细胞法测定 ,具有体内生物活性     

人血清白蛋白载体的构建及其在山羊乳腺中的瞬时表达

根据GeneBank中人血清白蛋白(HSA)的基因序列,设计一对特异性的引物,从人肝cDNA文库中扩增出其编码序列,并加入酶切位点XhoⅠ,以pCDNA 3.1为模板,设计特异性的引物,并在上游引物加入NotⅠ,下游加入ApaⅠ和NotⅠ,扩增出筛选标记新霉素抗性基因neo,然后再以pBC1为基本骨架,在其NotⅠ、XhoⅠ位点处分别插入hsa和neo,从而得到乳腺表达载体pBC-NEO-HSA,将该质粒注射入奶山羊乳腺中进行暂时性的表达,结果显示所构建的载体能够有效地指导目的基因的表达,从而为下一步构建细胞系、克隆动物作好基础。     

人血清白蛋白基因乳腺表达载体在奶山羊乳腺中的瞬间表达

构建了包括人血清白蛋白 ( h ALB)基因的 c DNA全序列、内含子 1以及山羊β-酪蛋白基因启动子和 5′端上游调控序列在内的乳腺表达载体 pc DNA3.1 -GCALBm,采用直接注射法将其导入哺乳期的奶山羊乳腺组织 ,然后通过放射免疫法测定乳汁中 h ALB的含量。结果显示 ,5头受试奶山羊的乳汁中有明显的 h ALB表达 ,注射后第 2天放免测定值从注射前的 4 .0 mg/L左右分别上升至 62 .2、59.2、36.2、4 2 .3、1 7.5mg/L,并持续表达在 2周以上 ,其中 1头受试羊乳汁中 h ALB的表达量维持在 80 mg/L左右 ,并超过了 1 0 0 d。而在乳腺组织中注射 pc DNA3.1空质粒或生理盐水的 4头对照奶山羊的乳汁中 ,放免测定值无变化。     

人红细胞生成素转基因小鼠乳腺生物反应器的建立

将 ２．４ ｋｂ 的人红细胞生成素（ｈ Ｅ Ｐ Ｏ）基因组基因（ｇ Ｄ Ｎ Ａ）ｍ ｉｎｉｇｅｎｅ 克隆于 ０．９７７ ｋｂ 大鼠乳清酸蛋白（ Ｗ Ａ Ｐ）５′调控序列下游和 ０．８５ ｋｂ Ｗ Ａ Ｐ３′侧翼序列上游,构建了 ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 乳腺定位表达载体 ｐ Ｗ Ａ Ｐ Ｅ Ｐ Ｏ Ｗ Ａ Ｐ３′ Ｕ Ｔ Ｒ（ｐ Ｗ Ｅ３′）。载体经 Ｓａｃ Ｉ Ｉ酶切、回收并纯化后作为目的基因,通过显微注射方法导入小鼠受精卵的雄原核,共注射 ５００ 枚卵,移植 ３００ 枚卵至 ２９ 只假孕母鼠输卵管内,获得仔鼠 ５５ 只。采取鼠尾,提取基因组。经 Ｐ Ｃ Ｒ 检测,阳性鼠 ２２ 只; Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,阳性鼠 １６ 只,其中 ９ 只母鼠,７ 只公鼠。将 １６ 只首建者小鼠分别与非转基因鼠交配,共获得 Ｆ１ 代仔鼠 １５７ 只。应用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法对 Ｆ１ 代小鼠进行检测,结果首建者１ 号母鼠所生的 ６ 只仔鼠中有 ３ 只为阳性。与此同时,于 ９ 只雌性首建者分娩后第 １０ 天采奶,应用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法对乳汁中的 Ｅ Ｐ Ｏ 进行检测,结果 ６ 只母鼠获得表达,表达量为 ０．１２～１．５９ μｇ／ Ｌ。     

奶牛bTAP蛋白表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。     

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf9细胞中的表达

对人胰岛素基因真核表达载体（pCMA／mINS）进行Xho I酶切，回收的含人胰岛素基因组基因的1608bp片段与线性化的杆状病载体pFast Bac I进行连接，获得重组载体pFast/mINS。将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经2次抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组载体Bacmid/mINS。将该载体转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒，经Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting检测，重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原，而细胞培养上清中未检测到胰岛素和胰岛素原。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术，从小鼠基因组中克隆了1．6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5’上游调控序列，经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达，将此序列与报告基因CAT融合，构建了pWAP—CAT—polyA乳腺定位表达载体，脂质体包裹后，经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后1—10d采奶，用ELISA检测乳汁中CAT含量。结果表明，所构建的载体在家兔乳腺中能够表达，表达水平在家兔分娩后1—5d较高。     

转基因动物乳腺通用表达载体的构建

为进一步研究羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因在转基因大动物中的应用,利用克隆的羊ＢＬＧ基因５′和３′区的５ｋｂ和４．２ｋｂ构建乳腺表达载体。为有效利用内含子的作用,克隆了羊ＢＬＧ第１和第２内含子,进行了序列分析,并将２个内含子进行了拼接,构建了有效的乳腺表达载体。该载体方便从原核载体中卸出,并加入３个有利于外源基因插入的克隆位点     

奶牛乳铁蛋白肽真核表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

实验用奶牛乳铁蛋白肽特异性PCR引物从奶牛乳腺组织中扩增奶牛乳铁蛋白肽基因,然后将其连入pCMV-N-eGFP载体中,构建奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并将其转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用蛋白质免疫印记和牛津杯法等方法检测GFP-LfcinB蛋白在细胞中的表达及其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果表明,试验成功的建立了奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗金黄色葡萄球菌活性的GFP-LfcinB蛋白.     

人c-myc乳腺定位表达转基因小鼠的建立

以含有 1.6 kb的小鼠乳清酸蛋白 (WAP)上游调序列的 p CAT- WAP和含有人 c- myc c DNA的 p WM为原始质粒 ,构建了 WAP启动子调控下的 c- myc乳腺定位表达载体 p WCS。载体用 Bgl Bam H 酶切 ,回收 3.5 kb的基因片段 WAP- c- myc- SV40 Poly A,通过显微注射方法导入 C5 7BL/ 6 J× DBA/ 2 JF1 代小鼠受精卵的雄原核内。共注射10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 45只。PCR检测 ,阳性鼠 9只 ,South-ern blot检测 ,阳性鼠 3只 ,其中 1只母鼠 ,2只公鼠 ,在饲养过程中 ,1只母鼠意外死亡。对 2只转基因公鼠的 F1代PCR检测表明 ,仅 1只公鼠具有遗传性 ,在所生的 2 7只 F1代小鼠中有 13只为 PCR阳性。     

人Bcl-2乳腺定位表达转基因小鼠的建立

以 p CAT、p WB和 p WC为原始质粒 ,构建 WAP启动子调控的 Bcl- 2乳腺组织特异性表达载体 p WBS。载体用Bgl +Sal +Pvu 酶切 ,回收 3.0 kb的基因片段 WAP- Bcl- 2 - SV40 Poly A,通过显微注射方法导入 C5 7BL / 6 J×DBA/ 2 JF1代小鼠受精卵的雄原核内。共注射 10 0 0枚卵 ,将存活的约 6 0 0枚卵分别移植至 2 9只假孕母鼠输卵管内 ,获得仔鼠 5 5只。PCR检测 ,阳性鼠 12只。Southern blot检测 ,阳性鼠 4只 ,其中公、母鼠各 2只 ,在饲养过程中 ,2只公鼠均意外死亡。Western blot证实 ,1只母鼠 Bcl- 2表达阳性 ,其 F1代的 40只小鼠中 ,有 18只呈 PCR阳性 ,其中母鼠8只 ,在 5个月的反复怀孕过程中 ,未观察到乳房有任何肿瘤或肿块的出现 ,证实 Bcl- 2单独在转基因鼠乳腺中表达不会引起转基因鼠乳腺癌的发生。     

多个顺式作用元件调控t-PAcDNA乳腺定位表达

由牛 β-酪蛋白 ( β-Casein)启动子与大鼠乳清酸蛋白 ( WAP)启动子融合及串联构建成 2个组织纤溶酶原激活剂 ( t-PA) c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-βΔWAP-PA和 p SVL-WAPβ-PA。将这 2种表达质粒分别注入怀孕家兔乳腺导管中 ,溶圈试验结果显示 ,2种质粒均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 5天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 70 0 μg/ L和 50 0 μg/ L。本试验为进一步研究 t-PA基因乳腺定位表达调控和建立 t-PA乳腺生物反应器奠定了基础     

基因打靶与体细胞克隆技术制备乳腺生物反应器的研究进展

在动物乳腺生物反应器研究中,传统方法不可避免地造成基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高且差异较大。而基因打靶在外源基因定点整合、消除位点效应方面具有明显优势。体细胞核移植技术可以提前在细胞水平对转基因动物进行筛选,不但可以节省时间,更降低了制备乳腺生物反应器的成本。作者简述了基因打靶与体细胞核移植技术结合制备乳腺生物反应器的优越性、存在问题、解决办法及其应用前景和展望。     

Study on Expression of SYK in Dairy Cow Mammary Gland

To investigate the relationship between the expression of SYK and dairy cow mammary gland development and lactation, the expression of SYK in lactating dairy cow mammary gland with high or low quality milk and dry period Holstein dairy cow mammary gland was detected by Western blotting and laser confocal microscope.The results showed that SYK expression in dry period mammary gland was significant higher than that in lactating mammary gland (P<0.05).There was no SYK differential expression detected between lactating mammary gland with high quality milk and low quality milk (P>0.05).SYK was mainly located in the cytoplasm of ductal epithelial cells in dry period mammary gland.In lactating mammary gland, SYK was existed in acinar epithelial cells.All these results revealed that SYK was a regulator in mammary epithelial cell proliferation and differentiation.It participated in mammary gland reconstitution in dry period.     

脾源性酪氨酸激酶基因在奶牛乳腺中的表达研究

为探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)的表达与奶牛乳腺发育和泌乳功能之间的关系,试验采用Western blotting和激光共聚焦显微技术对泌乳期高乳品质、低乳品质及干乳期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中SYK的表达含量和表达部位的变化进行研究。结果表明,干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期奶牛乳腺组织(P<0.05),泌乳期高乳品质、低乳品质奶牛乳腺组织中SYK的表达差异不显著(P>0.05);在干乳期SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达,而在泌乳期SYK在腺泡上皮细胞中表达。结果提示SYK是乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子,主要参与干乳期乳腺组织的重建过程。