猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及primer—walking的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,采用PCR—RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行了分析。[结果l脂联素基因的5’侧翼区-1010bp（G／A）的SNP位点,本地猪种中GG基N型频率明显高于外来猪种;-394bp（T／C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种申却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1010bp（G／A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394bp（T／C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关．     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究（摘要）

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及引物步移法（primer-walking）的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,具体步骤：通过已经发表的部分猪脂联素基因cDNA序列设计特异引物用于BAC克隆的筛选。以超级池DNA为模板进行第1次PCR反应,筛出含阳性克隆的超级池;以挑出的阳性超级池的3维池DNA为模板进行第2次PCR反应,根据阳性板池、列池、行池序号得到可能的阳性克隆号;依照阳性克隆号从工作文库中取出相应的BAC克隆,平板划线37℃倒置培养20 h。待菌落长好后,做菌体PCR鉴定,以确认克隆的正确性。将获得的BAC阳性克隆平板划线,37℃摇菌过夜培养,进行BAC的提取、纯化与酶切回收。先以M13引物向BAC两端测序,再以发表的cDNA序列外显子1设计测序引物采用primer-walking的方法,获得连续的DNA序列。采用PCR-RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行分析。[结果]脂联素基因的5′侧翼区-1 010 bp（G/A）的SNP位点,本地猪种中GG基因型频率明显高于外来猪种;-394 bp（T/C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种中却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1 010 bp（G/A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394 bp（T/C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关。     

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2 cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆并分析广西巴马小型猪脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2）编码基因的cDNA全序列。[方法]利用RT-PCR法,以骨骼肌总RNA为模板,分别扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA序列,纯化后连接pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序,并与其他物种AdipoR1和AdipoR2 cDNA序列进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增得到大小与AdipoR1和AdipoR2基因编码序列大小相同的片段,片段长度为1 128和1 161 bp。同源性比较分析发现,广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素受体同源性分别高达99.8%、99.7%,分别有1处和3处发生了碱基错义突变。[结论]该试验成功克隆了广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA,为进一步研究AdipoR基因的生物功能及设计以AdipoR为靶标的新型药物奠定了基础。     

脂联素基因及其对猪脂肪沉积的影响研究进展

脂联素具有调控生物体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢等功能,是至今发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白。介绍了脂联素的基因结构、分子结构及生物学功能,综述了脂联素基因对猪脂肪沉积的影响研究进展。     

用竞争PCR方法定量检测猪MHC-DM mRNA

根据GenBank中猪MHC-DM基因序列,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪DM基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了其缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了猪DM标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简便,特异性和敏感性高,可用于猪DM mRNA水平的定量检测。     

脂联素对动物脂肪沉积调控的影响

脂联素（Adiponectin）是脂肪组织分泌的脂肪细胞因子之一,对脂肪沉积具有重要的调节作用。它主要是通过对AMP激活的蛋白激酶（AMPK）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）等细胞因子作用,增加脂肪酸氧化,减少脂肪沉积。现就脂联素及其受体分子的结构和组织分布、AMPK、PPARα、p38 MAPK3因子对脂肪沉积的调节作用机理,以及在畜禽中的研究进展作一综述,望能为提高畜禽生产水平提供一个新的思路。     

猪CD80 mRNA定量检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪CD80基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了CD80的缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了CD80标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简单,特异性和敏感性高,可用于猪CD80 mRNA水平的定量检测,从而为分析猪的免疫状态提供了一种重要技术手段。     

猪CD86 mRNA定量检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪CD86基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了CD86的缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了CD86标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简单,特异性和敏感性高,可用于猪CD86 mRNA水平的定量检测。     

猪GM-CSF荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因序列设计一对引物,用RT—PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增出296bpcDNA片段,并克隆到pGEM—TEasy载体中。经测序鉴定后,构建出含猪GM—CSFcDNA部分片段的重组质粒。通过重组质粒的Real—timePCR方法,建立了猪GM-CSFcDNA的Real—timePCR标准曲线及其直线回归方程。该方法重复性好,敏感性高、特异性强,可用于猪GM—CSFmRNA水平的定量检测。     

猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。     

应用内含子法构建PC基因mRNA竞争RT-PCR内参照

 运用PC基因mRNA与PC基因DNA相比缺少1个81bp内含子序列的基本原理,应用PCR技术和生物工程原理,通过1对引物,进行1次克隆,成功构建了PC基因mRNA的466bp竞争DNA模板重组质粒,PC基因mRNA与PC基因DNA可以互为内参照。为应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖代谢过程中PC基因mRNA水平奠定方法学基础。     

PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

【目的】利用PCR技术,无需增菌，直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。【方法】通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板，以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，经过PCR扩增得到279 bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。采用PCR方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌，同时，与国标GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片Petrifilm RSA.Count Plate 及Baird-parker+RPF Agar进行了比较。【结果】PCR方法的灵敏度高，全脂乳和脱脂乳检测的检出限为10 CFU/ml，奶酪检测的检出限为55 CFU/g，可在6 h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24 h。与国标方法相比，PCR方法的符合率为94.3％，敏感性为100％。【结论】采用溶剂提取制备模板的方法可有效的用于PCR直接检测(无需增菌)乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌。     

奶牛边缘无浆体病的PCR鉴定

采集黑龙江省齐齐哈尔市、嫩江市、大庆市和安达市奶牛场具有无浆体病症状奶牛血液样本,用PCR方法扩增边缘无浆体msp5基因,然后将扩增的DNA片段克隆测序,并进行同源性分析。结果发现扩增的4个基因序列与标准边缘无浆体(Anaplasma.marginale)同源性均大于99.5%,与Genbank上已发表的边缘无浆体msp5基因序列同源性百份率均不低于95.8%,进而首次从分子水平证实黑龙江省存在奶牛无浆体病。     

Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay

A polymerase chain reaction （PCR） assay was employed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. A solvent extraction procedure was successfully modified for the extraction of Staphylococcus aureus DNA from artificially contaminated whole milk, skim milk, and cheese. A primer targeting the thermostable nuclease gene （nuc） was used in the PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. The PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the PCR, GB-4789.10-94, Perifilm RSA.Count Plate, and Baird-Parker ＋ RPF Agar were compared. The sensitivity of the PCR was 10 CFU mL^-1 of whole milk, skim milk, and 55 CFU g^-1 of cheese. The developed methodology allowed for detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h. The time taken for the development of this PCR assay was 12-24 h, less than the time taken by the general PCR assay using the enrichment method, and the coincidence rate of this developed PCR was 94.3%, the sensitivity was 100%. It was a rapid, sensitive, and effective method for PCR to detect Staphylococcus aureus in milk and milk products.     

Establishment of Real-Time TaqMan-Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection and Quantification of Porcine Lipoprotein Lipase mRNA

Porcine lipoprotein lipase （LPL） cDNA was cloned as the standard for real-time quantifying LPL mRNA and the TaqMan-fluorescence quantitative PCR assay for detection was established. The total RNA extracted from Longissimus dorsi of porcine was reverse-transcribed to cDNA. LPL cDNA was ligated with pGM-T vector and transformed into Escherichia coli TOP10. Plasmid DNA extracted from positive clones was verified by PCR amplification and sequenced. LPL was amplified by real-time fluorescence quantitative PCR from the plasmid DNA. The concentration of DNA template purified was detected by analyzing absorbance in 260 nm and then the combined plasmid was diluted to series as standard for fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR）. The method of LPL mRNA real-time PCR was well established, which detected as low as 103 with the linear range 10^3 to 10^10 copies. The standard curves showed high correlations （R2 = 0.9871）. A series of standards for real-time PCR analysis have been constructed successfially, and real-time TaqMan-fluorescence quantitative RT-PCR is reliable to quantitatively evaluate FQ-PCR mRNA in L. dorsi of porcine.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPL mRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPL cDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR 检测。纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPL mRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103 ～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准,且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPL mRNA的表达进行准确定量。     

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒. 利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子. 通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.     

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

为检测牛奶中的布鲁氏菌,通过对布鲁氏菌外膜蛋白31 k Da的一段基因进行套式PCR扩增,建立从临床奶样中检测布鲁氏菌的方法。改进了奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法,通过正交试验的方法优化了套式PCR试验的反应条件,优化后的一扩PCR反应条件为:退火温度56.4℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.2μL,引物0.3μM,d NTP浓度0.2 m M;二扩PCR反应条件为:退火温度53.3℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.25μL,引物0.4μM,d NTP浓度0.1 m M。其敏感性为8 CFU·m L~(-1),比细菌分离试验敏感1 000倍;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌均无交叉反应;与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%,阴性符合率是86.36%。试验建立的套式PCR方法可用于检测奶样中布鲁氏菌。     

PCR技术与植物病理学的结合

本文综述了聚合酶链式反应（ＰＣＲ）在植物病原物检测、病原物定量、病菌生理小种鉴定以及其它植物病理学领域的应用。     

聚合酶链式反应技术的研究进展

聚合酶链式反应技术自诞生以来,已在生物学及相关学科中得到了广泛应用,并得以不断的深入和发展。本就近年来研究和发展出现的一些特殊ＰＣＲ技术,如：逆转录ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、锚定ＰＣＲ、重组ＰＣＲ、长ＰＣＲ、热起动ＰＣＲ、免疫ＰＣＲ、复合ＰＣＲ、差向显示ＰＣＲ等作一简这,以供参考。