慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98%,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。将LAT52启动子与GUS基因拼接,构建成了双元表达载体。     

木薯SBEI基因片段克隆及块根特异性反义表达载体的构建

为了抑制木薯支链淀粉的合成,提高直链淀粉含量,改变木薯淀粉结构,培育工业用燃料酒精型木薯品种,本研究利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEI的部分片段,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同源性为99.22％;并以pBI121为基础,构建了以块根特异性表达启动子Sporamin驱动的SBEI基因反义结构的植物表达载体。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

蓝猪耳胚珠磷脂酶C基因TfPLC1启动子的克隆及载体构建

应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳全基因组DNA分别经DraI、EcoRV、PvuII、SmaI消化后与衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到两个大小为798bp、813bp的TfPLC1基因上游序列；经测序、blastn比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在其远端上游区域还有多个AT富含区，而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5’端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700，用于转化蓝猪耳，以验证该启动子的功能。该启动子的克隆对于研究蓝猪耳胚珠TfPLC1基因的表达调控及功能具有重要意义。     

从原始生殖细胞分离昆明小鼠EG细胞及其传代培养

为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因（XM₀02525863.1）的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。     

牛α1，3-半乳糖转移酶基因部分片段的克隆及无启动子打靶载体的构建*

利用La-PCR的方法,从牛的基因组中成功地获得2．4kb和5．2kb的扩增产物。其中2．4kb片段位于5～7外显子之间,包括了完整的第5及第6内含子;5．2kb片段位于8～9外显子,包括了完整的第8内含子。2个片段分别克隆于pCR-XL-TOPO载体。测序结果表明所克隆的两片段均为牛α1,3半乳糖转移酶基因的基因组序列。2．4kb和5．2kb的两个片段分别作为打靶载体的5’、3’同源臂构建了无启动子打靶载体TOPO-IRESneo7．6。电击转染牛胎儿成纤维细胞以期敲除牛的α1,3半乳糖转移酶基因。     

牛Oct4基因克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒.     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

小鼠肾组织中EGF基因的克隆及其植物表达载体的构建

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，在临床上具有重要的应用价值。由于天然EGF来源有限，用基因工程方法生产EGF蛋白已成为一个重要的替代途径。本研究用RT—PCR法从小鼠的肾组织中克隆了EGF基因，并构建到植物表达载体上，为EGF基因在高等植物细胞中的表达奠定基础。     

水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

长爪沙鼠TLR4基因片段克隆及其在脏器中的表达和分布特征

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与调节先天免疫的一类具有高度保守性的蛋白受体.为克隆长爪沙鼠(Meriones unguiculatus) TLR4基因片段,分析其在内脏组织中的分布特征,本研究通过分析比较大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)与仓鼠(Mesocricetus auratus) TLR4基因序列,选择保守区设计引物,扩增长爪沙鼠TLR4基因片段;将所得片段连接到克隆载体上,测序并使用DNASTARMeglign软件分析该序列与其他不同种属动物TLR4基因序列同源性;采用半定量PCR与免疫组织化学技术分析TLR4在正常长爪沙鼠脏器组织中的表达情况.结果显示,本研究成功克隆了长爪沙鼠TLR4基因片段(GenBank登录号:KX137123),BLAST分析比对发现,与其他鼠类的TLR4基因同源性在87.4％以上,与仓鼠的同源性较高(89.1％),与人(Homo sapiens)、猪(Sus scrofa)的TLR4同源性较低,分别为69.5％和73.1％,提示长爪沙鼠与仓鼠的亲缘关系较近,与人和猪的亲缘关系较远.半定量PCR分析结果显示,TLR4基因在长爪沙鼠心、肝、脾、肺和肾中呈差异表达,以肺脏中表达量最高,肝脏中表达量最低.免疫组化结果表明,在长爪沙鼠的肺脏和脾脏组织中可见较多TLR4阳性反应产物,在肺脏中阳性反应产物主要见于肺泡支气管上皮细胞;在脾脏中阳性反应产物主要见于脾小结周围的边缘区,淋巴小结内也可见少量分布;肾脏中偶见阳性反应产物分布,心脏和肝脏上均未检出,这与转录水平结果较一致.研究结果为探究长爪沙鼠先天免疫及其作为良好的动物感染模型提供了理论依据.     

桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

为探究桃NAC基因对类胡萝卜素积累的调控作用,本研究从桃中克隆得到PpNAC19基因.序列分析表明,PpNAC19(XP_007223324.1)开放阅读框为867 bp,编码288个氨基酸,预测蛋白质分子量为33.2 kDa,平均疏水系数为-0.719,属于亲水性蛋白,含有一个典型的NAM结构域.亚细胞定位预测PpN...     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。