双表达H9N2禽流感病毒HA基因的假型重组杆状病毒系统的构建

以含有H9N2禽流感病毒HA基因的重组质粒pMD18-H9HA为模板,扩增HA基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将含有H9HA及gp64的基因片段克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA-H9-HA.然后将含有CMV启动子、H9HA及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质...     

H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因的原核表达

采用自行设计的引物,通过PCR的方法,分别从pMD-HA5和pMD-HA9中成功扩增出AIV 0025(HSN1)株和KMⅢ(H9N2)株的血凝素(hemagglutinin,HA)基因,然后分别亚克隆到pET-32a( )、pET-28a( )表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,分别标记为pET32-HA5、pET28-HA9.将阳性重组质粒转化进B121(DE3)宿主菌中,通过改变IPTG浓度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定了最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间4～5 h.经SDS-PAGE和 Western-blotting 分析表明,重组蛋白相对分子质量约为85 000和63 000,主要存在于包涵体中,具有良好的免疫学活性.     

昆虫杆状病毒表达系统在禽流感病毒研究中的应用

禽流感的防控,主要在疫苗的免疫和平时的监测以及发病后的快速诊断等多个方面采取综合措施才能取得较好效果,这就需要建立快速、特异的诊断、检测方法以及不断开发新型疫苗用于禽流感的免疫。昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,现已成功表达了近千种高价值蛋白。其在禽流感病毒中的应用,为禽流感防控所需的特异性抗原,诊断、检测方法的建立,新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

H9N2禽流感病毒HA全长基因的高效可溶表达及免疫原性研究

采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒（AIV）广东株的血凝素基因HA．将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上，成功构建重组表达质粒pMBX-HA．将其转化到E.coli BL-21感受态细胞中表达，经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96200的融合蛋白，表达产物占菌体总蛋白的29．5％．经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的．Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H9N2 AIV阳性血清具有良好的免疫反应性．将可溶表达的融合蛋白用体积分数为50％的Ni-NTA树脂过柱纯化，用融合蛋白作抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出禽流感阳性血清．     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

一株H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。通过T-A连接将已加A尾的PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-Teasy vector,转化J M109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段。对目的片段进行测序,结果获得该毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的可达98%,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,该毒株属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该分离株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,其排列顺序为-PARSSRGLF-。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防AI提供了理论依据。     

表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化

根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行 PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,...     

H5亚型禽流感病毒HA基因在WISH细胞中的瞬时表达

在WISH细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染WISH细胞。通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在WISH细胞中进行了表达。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

一株H9N2型禽流感病毒全基因的序列分析

采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒A/chicken/Zhuhai/154/03(H9N2)的8个基因片段(HA,NA,M,NP,NS,PA,PB1,PB2)。然后将其克隆到线状克隆载体pGEM-Teasy vector后进行序列测定和拼接,并将克隆到的8个基因片段与其他禽流感病毒毒株(A/Chicken/Guangdong/SS/94,A/Swine/Hong Kong/9/98-MA,A/Chicken/Shanghai/F/98,A/Duck/Hong Kong/Y439/97,A/Quail/Hong Kong/G1/97,A/Chicken/Shanghai/4/01)各个基因的相应序列进行比较分析。结果表明:克隆到的A/chicken/Zhuhai/154/03(AZH154)株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:AZH154的各基因与A/Chicken/Guangdong/SS/94株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有67.5%),与A/Chicken/Shanghai/4/01各基因同源性高于A/Swine/HongKong/9/98-MA,A/Duck/Hong Kong/Y439/97和A/Chicken/Shanghai/F/98各基因同源性。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防禽流感(AI)提供了科学依据。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

禽流感病毒H9N2亚型HA基因的序列分析

试验对1株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增、克隆,然后对毒株的HA基因进行阳性克隆鉴定。测序结果表明:所扩增的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;该毒株的裂解位点的氨基酸序列为R-S-S-R,属于低致病力毒株,该毒株有7个潜在糖基化位点,受体结合位点的氨基酸分别为YWT-NVLY,左侧壁氨基酸为NGQQG,右侧壁为GTSKA。将该毒株与国内一些参考毒株的HA基因序列进行比较分析,结果表明,核苷酸与氨基酸同源率较高,核苷酸同源率为93.0%~97.3%,氨基酸同源率为95.4%~96.6%,亲源关系比较近;与韩国毒株核苷酸和氨基酸同源率分别为83.3%和87.3%,亲源关系比较远。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律。[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（H9N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株HA基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分别与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株（序列号分别为AF156376,AF156377,AF156378,AF461517,AF461519．AF461521,AF461530,AY364228,AY862606,D90305）进行比较分析,并绘制进化树。[结果]4个毒株HA基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％．其中MY株和ZD株HA基因同源性和氧基酸同源忡均为最高：WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10个毒株的核苷酪和氧基酪序列同源性分别为82．6％-95．1％、83．0％-99．0％、82．7％～95．5％和81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．0％～97．1％、86．9％-97．3％,遗传进化树分析表明,H9N2的HA基因的进化树有2个大的分支,分为2个种系：欧亚种系和北美种系。欧亚种系又分为3个群系,分别以A／Quailf HongKong／G1／97（AF156378）,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Duck／HongKong／Y280／97（AF156376）为代表株,将这4个分离株与国内一些参考株、韩国代表株（AY862606）以及上述欧亚种系代表株的HA基因序列进行比较。结果表明,MY株、WD株、PG株和zD株均属于欧亚种系,并且都属于A／Duck／HongKong／Y280／97群系,与国内参考株的亲缘关系都较近,而MY株与A／ChickenfShandong／2／99（AF461521）亲缘关系最近。PG株与A／Chicken／Liaoning／2／00（AF461519）的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到97％。ZD株与A／Chicken／Beijing／1／97（AF461530）的亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸的同源性都是最高的,分别达95．7％、97．3％。韩国株（AY862606）则属于A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）群系。总体来看,这4个分离株与国内参考株亲缘关系较近,而与韩国株（AF156377）较远。4个分离株除WD株的HA基因裂解位点为PSRSSR／GLF,MY、PG和ZD株的HA基因裂解位点均为PARSSR／GLF,WD株裂解位点附近的A变为S,也就是由丙氨酸变为丝氨酸,S也是非碱性氨基酸,因此,致病力没有变化,这4个分离株均为低致病性禽流感病毒。HA基因的几个受体位点分别为109aa,161aa,163aa,191aa,198aa,202aa,203aa,通过比较除了PG株的198aa为丙氨酸（Ala）,其他3个都为缬氨酸（Via）。编码198aa的3个碱基由GTG突变为GCG,其他参考株的198aa变异性也较大,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Quail／HongKong／G1／97（AF156378）的198aa都是谷氨酸（Glu）,还有的国内株为T。这4个分离株的其他几个受体结合位点的氨基酸都是一样的,然而,通过对10个参考株的比较发现,191aa也容易发生变异,有的变为组氨酸（His）。202aa和203aa在所有的毒株中都比较保守。[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性。但有很多因素能够影响其HA基因的变异,从而影响其致病力,这与地域因素有很大的相关性,因此,应加强地域间的防控。