三疣梭子蟹选育家系微卫星分析

采用微卫星标记技术分析不同世代三疣梭子蟹选育家系的遗传结构。利用16个多态性微卫星位点分析了三疣梭子蟹家系F1到F4 4个选育家系的遗传结构与遗传多样性变化情况。结果显示,随着选育的进行,4个世代家系遗传多样性指标值逐渐下降,F1到F4 16个微卫星位点的平均多态信息含量从0.675 3下降到0.406 1,平均等位基因数从3.500 0下降到2.133 3,平均观测杂合度从0.643 5下降到0.4774,平均等位基因纯合率从0.566 9下降到0.402 4。对各个位点进行H-W检验,每个世代出现不同程度的平衡偏离。对各家系进行F-检验,结果表明,各家系存在不同程度的遗传分化,19.07%的遗传分化来自群体间,80.93%的遗传分化来自群体内。另外,对FIS值的计算显示,4个家系在整体上均表现为一定程度的杂合子缺失,其中F4有12个位点、F3有6个位点、F2有3个位点、F1有8个位点处于杂合子缺失状态。遗传距离逐渐增加,相邻世代间的遗传相似性逐步升高。经过连续4代的选育,选育群体的遗传基础逐步得到纯化,基因型逐渐趋向纯合、稳定,经进一步的选育可望获得较稳定的品系。     

微卫星DNA标记用于三疣梭子蟹家系亲子关系的鉴定

以定向交尾技术构建的4个谱系清晰的家系为材料,检测两对微卫星标记Pot17和Pot42在三疣梭子蟹家系鉴别中的应用效果。结果表明,两个位点在4个家系的5个已知父母本和98个后代中共检测出11个等位基因,其中Pot17位点6个,Pot42位点5个。分析显示,上述检出的等位基因频率在0.0291和0.3592之间,Pot17和Pot42位点的期望杂合度分别为0.7740和0.7577,观测杂合度分别为0.6214和0.6796,多态信息含量分别为0.7373和0.7129。根据已知亲本和子代基因型,推断出了4个家系全部亲本的基因型。Pot17和Pot42微卫星标记具有达0.995的较高累积个体识别率,可以用于三疣梭子蟹的亲子关系鉴定。     

三疣梭子蟹基因组微卫星特征分析

对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)部分基因组DNA文库测序,获得了总长度为622409个碱基的基因组DNA序列,从中找到微卫星重复序列(1～6bp重复)697个.统计微卫星重复类型,以两碱基重复数目最多,为445个,占微卫星序列总数目的63.84%;其次是三碱基重复152个,占21.81%;再次分别是单碱基重复45个,占6.46%;四碱基重复31个,占4.45%;五碱基重复14个,占2.01%;六碱基重复1个,占1.43%.在单碱基重复类型中,重复拷贝类别全部为A:两碱基重复类型中,AG重复数目最多,其次是AC和AT;三碱基重复类型中以ACT最多,其次是AGG和AAT;四碱基重复类型中,AGAC重复数目最多;五碱基重复类型中,以AACCT重复拷贝类别最多;六碱基重复中以AGGGGA重复数目最多.GC重复拷贝类别的重复数目很少,只发现1个(GenBank注册号为EU113241).     

三疣梭子蟹多态性微卫星DNA标记的筛选及评价

根据前人FIASCO方法构建的三疣梭子蟹微卫星富集文库,对含微卫星的DNA序列设计了71对引物并对其进行了多态性筛选,筛选出21对多态的微卫星引物,对三疣梭子蟹1个野生群体的30个个体进行遗传多样性检测,同时对引物进行评价。21个位点共获得了188个等位基因,平均每个位点扩增得到8.9个等位基因。不同引物获得的等位基因数差异较大,从3～13个不等,其中Pot8、Pot37、Pot48、Pot53、Pot54、Pot66六个位点分别获得了11、12、12、11、13、11个等位基因,而Pot46仅获得了3个等位基因。等位基因的大小分布在131～312bp,基本符合引物设计时理论产物长度。21个微卫星位点的期望杂合度的范围为0.659～0.889,PIC值均高于0.5,表明它们都有很高的杂合度,均可用于三疣梭子蟹种群遗传结构分析,为三疣梭子蟹品种选育、种系评估提供更多的微卫星DNA信息。     

三疣梭子蟹微卫星标记与生长相关性状的相关性分析

选用35个多态性微卫星标记,对三疣梭子蟹人工选育快速生长自交家系F2代(以2008年莱州湾群体雄蟹为父本和海洲湾群体雌蟹为母本交配产生F1代,随机选取F1代后代进行交配产生F2代自交家系)的110个个体进行遗传多样性研究。结果表明:35个位点共检测出87个等位基因,各位点等位基因数为2~4个不等,平均有效等位基因数为2.2个,观测杂合度平均值为0.646 5,期望杂合度平均值0.513 0,多态信息含量平均值0.449 1。经卡方检验,多数位点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)偏离Hardy-Weinberg平衡。采用SAS 9.1中的一般线性模型(general linear model,GLM)对微卫星标记与生长相关性状(全甲宽、甲宽、甲长、体高、体质量、第Ⅱ侧齿间距、第Ⅰ步足长节长、大螯长节长)进行连锁分析。结果表明,Pot08位点与体质量、全甲宽、甲长、体高、第Ⅱ侧齿间距显著相关(P<0.05),Pot42位点与体质量、甲长、大螯长节长、第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),Pot53位点与全甲宽、甲宽、大螯长节长显著相关(P<0.05),与第Ⅱ侧齿间距极显著相关(P<0.01),Pot57位点与第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),PTR8a位点与第Ⅰ步足长节长、体高、甲长显著相关(P<0.05),与体质量、第Ⅱ侧齿间距、全甲宽、甲宽极显著相关(P<0.01),PTR30位点与体质量和甲长显著相关(P<0.05),PTR131位点与体质量、全甲宽、甲宽显著相关(P<0.05)。其中,位点PTR8a可作为以体质量为选育目标的首选标记。     

三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建与群体遗传分析

采用富集文库-菌落原位杂交法分离了30个三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星标记.三疣梭子蟹基因组DNA经HaeⅢ酶切连接后.用固定了((AC)15和(AG)15探针的尼龙膜((Hybond N+)捕捉含有微卫星的片段.转化至大肠杆菌DH5α中.构建三疣梭子蟹微卫星富集文库.菌落原位杂交后.任意选取150个克隆进行测序.阳性克隆率为85.48%.利用软件设计了105对微卫星引物.筛选到稳定扩增标记56对.采用30个三疣梭子蟹个体进行多样性评价.30个位点均表现出多态性.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量(PIC)的范围分别为0.2222～1.000 0、 0.4367～0.9099和0.350～0.892.本研究筛选的微卫星位点将为下一步三疣梭子蟹遗传多样性分析、家系分析、遗传图谱构建和QTL定位等研究提供基础依据.     

应用SSR分析5个三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性

利用本实验室筛选的8个微卫星分子标记,对中国舟山(ZS)、海州湾(HZ)、青岛会场(HC)、莱州湾(LZ)和鸭绿江口(YL)5个三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)野生群体共计120个个体进行了遗传多样性分析.结果显示,8个位点共扩增到72个等位基因,平均等位基因数为9.0,平均有效等位基因数为5.467 7;平均多态信息含量为0.696 7;平均期望杂合度(Hc)为0.750 8.5个群体的期望杂合度由高到低依次为LZ(0.770 4)、HC(0.758 8)、YL(0.755 2)、HZ(0.741 5)、ZS(0.728 3).卡方检验可知,34个群体位点组合符合Hardy-Weinberg平衡,占总数的85％.5个群体间的遗传距离在0.245 1～0.517 9之间,HC和HZ的遗传距离最小,LZ和ZS的遗传距离最大;通过构建UPGMA聚类树,发现5个群体聚为南北两大支,HC和HZ两个群体遗传距离最近先聚到一起,再与ZS群体相聚,形成南方群体;YL与LZ群体相聚形成北方群体,最后南北两大群体聚为一支.分析群体间的Fst值可知,两两群体间的Fst值在0.054 8～0.108 3 (0.05＜Fst＜0.15)之间,群体间产生了极显著的遗传分化.     

三疣梭子蟹型微卫星标记的发掘及多态性分析

为发掘三疣梭子蟹Ⅰ型微卫星标记,实验运用生物信息学方法,从NCBI数据库已公开的13 985条三疣梭子蟹EST序列中搜索微卫星位点.结果显示,共搜索到287个微卫星位点,其中主要为二核苷酸重复序列(173个),占总数的60.3％;其次为三核苷酸重复序列(79个),占总数的27.5％;四、五、六核苷酸重复位点较少;在二核苷酸重复位点中,AC/GT重复位点最为丰富,占二核苷酸重复位点总数的53.8％,AG/CT重复次之,占二核苷酸重复位点总数的37.0％,AT和GC重复较少.挑选14个Ⅰ型微卫星标记在野生三疣梭子蟹群体中进行多态性检测,发现8个位点呈多态性,平均多态信息含量(PIC)和平均遗传杂合度(H)分别为0.57和0.63.其中6个多态性位点的PIC值大于0.5,呈现较高多态性特征.研究表明,基于三疣梭子蟹EST数据发掘Ⅰ型微卫星标记的方法切实可行.本研究发掘的Ⅰ型微卫星标记将为三疣梭子蟹遗传多样性评估、遗传连锁图谱构建和QTL分析提供有效的分子标记.     

放流三疣梭子蟹遗传多样性和贡献率初步研究

近年来我国沿海三疣梭子蟹自然资源明显下降,为恢复现有资源,辽宁省自2012年开始,连续实施了4年大规模人工放流工作。在目前的增殖放流中,为检测参与繁殖的三疣梭子蟹亲本和即将放流的子代间的遗传差异以及亲本对其子代的繁殖贡献率水平,利用10对具有丰富遗传多态性的微卫星分子标记,分别对9只三疣梭子蟹雌性亲本和179只即将放流的子代进行了遗传多样性分析及亲子鉴定。结果发现,子代的平均观测杂合度、平均期望杂合度和平均多态性信息含量数值均低于参与繁殖的雌性亲本,亲本和放流子代之间在观测杂合度、多态性信息含量参数方面并无显著差异(P0.05),但期望杂合度遗传参数存在显著差异(P0.05),子代的遗传多样性较雌性亲本呈下降的趋势。使用4个微卫星分子标记时,累积排除率≥0.998,亲子鉴定的准确率为56.98%;微卫星分子标记为6个时,累积排除率≥0.9999,准确率达到97.21%;当使用8个微卫星分子标记鉴定时,准确率达100%。同时发现,9只雌性亲本对子代均有贡献,最高为29.61%,最低为3.35%,不同亲本之间的贡献率存在显著差异(P0.05)。研究表明,微卫星可以作为有效的标记手段用于三疣梭子蟹增殖放流遗传评估中。上述试验结果将为我国三疣梭子蟹增殖放流的科学发展提供基础资料。     

放流三疣梭子蟹月间回捕率及繁殖贡献率研究

2015年6月,将约500万只人工繁育的三疣梭子蟹C2期稚蟹放流到辽宁盘锦沿岸海域.当年7月28日—10月3日在盘锦沿岸以地笼网回捕1671只三疣梭子蟹样本,剪其螯足,剥离肌肉,提取DNA,利用微卫星DNA分子标记进行亲子鉴定,开展个体识别.试验结果显示,120只为当年放流蟹,放流后苗种短期月间放流蟹占当月回捕蟹群体的...     

三疣梭子蟹4个野生群体遗传差异的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直电泳技术对三疣梭子蟹Portunus trituberbuculatus4个野生群体(鸭绿江口、莱州湾、海州湾和舟山)的同工酶进行检测,分析群体间的生化遗传差异.结果发现(1) 4个群体的多态座位百分数(P0.99)分别为:鸭绿江口13.6%、莱州湾13.6%、海州湾13.6%和舟山13.6%.(2) 4个群体间的生化遗传差异不显著,4个群体间的遗传距离D=0.000 54～0.001 70,属种内群体间差异.(3)聚类分析表明:4个群体分为两组,海州湾和舟山两群体之间的亲缘关系最近,聚为一组.莱州湾和鸭绿江口群体亲缘关系比较近,聚为另一组.     

三疣梭子蟹核型分析

实验用三疣梭子蟹于2003年3月－2004年6月购自浙江象山石浦港。以成熟卵、精巢、胚胎及溞状幼体等为材料进行三疣梭子蟹染色体数目和核型的研究。染色体制片采用组织切片法和气干法,用Olympus显微镜进行观测、摄影,依据Levan等的染色体分类标准进行核型分析。结果表明,精巢最适宜进行三疣梭子蟹染色体计数,卵内溞状幼体最适宜做核型分析。三疣梭子蟹染色体的数目是2n=106,n=53。核型分析显示,三疣梭子蟹有20对（第1～20号）中部着丝粒染色体（m）、3对（第21－23号）亚中部着丝粒染色体（sm）和30对（笫24～53号）端部着丝粒染包体（t）。因此,三疣梭子蟹核型为2n=106=40m＋6sm＋60t,染色体臂数NF=152;没有检查出异形性染色体的存在。     

三疣梭子蟹自交与杂交家系子一代生长和存活的比较

选择繁殖性能好的A家系(F6)和生长与存活好的B家系(F3),设计家系内自繁和家系间杂交,比较其自交组与杂交组子一代的生长与存活,评价杂交效应。由自交组F66(A♀×A♂)、F33(B♀×B♂)和杂交组F63(A♂×B♀)、F36(B♂×A♀)4个实验组组成,比较各实验组子一代在80、100、120、150日龄时的各生长指标杂种优势。研究表明,同一生长发育阶段的同一杂交群体的不同性状,表现的杂种优势大小有很大差异,而且同一杂交群体的同一性状在不同生长发育阶段表现的杂种优势大小同样有差异。自交组各阶段全甲宽、甲宽、甲长和体高的生长趋势比较一致,为F33F66;不同生长性状的生长速度方面,杂交组具有不同程度的总体杂种优势(-3.50%-19.47%)。结果显示,就存活而言,杂交组比自交组的存活率杂交优势明显,总体杂种优势率为24.8%,与存活相关的养殖产量的总体杂种优势率为15.99%,无论是生长性状还是存活,杂交使A家系获得的改良效果比B家系的好。A、B两个家系间存在的遗传差异获得杂种优势,是性状得到改良的基础。     

三疣梭子蟹4个野生群体形态差异分析

通过对鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个野生群体的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)14项生物学外部形态性状的测量,采用多元分析方法对其进行比较分析。聚类分析结果表明,海州湾、舟山2个群体形态最为接近,鸭绿江口和莱州湾2个群体形态较为接近。对样本所属群体进行判别分析,4个群体雌蟹的综合判别率为87.0%,其中海州湾最低,为80.0%;莱州湾最高为92%。4个群体雄蟹的综合判别率为80.8%,其中海州湾最低,为72.0%;鸭绿江口最高,为96%。并建立4个群体各自的判别函数公式。通过对16项形态比例参数进行单因素方差分析,找到了4个群体间存在显著差异的形态比例参数。3种分析结果均认为,4个群体三疣梭子蟹在形态上已产生一定程度的差异,但所有的差异均未达到亚种水平,需要多项参数综合判别才能将4个群体的三疣梭子蟹区分开。     

莱州湾三疣梭子蟹的生化遗传分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳技术对三疣梭子蟹的同工酶进行检测。分析了13种同工酶在莱州湾三疣梭子蟹肌肉中的表达情况,并对同工酶的表型进行了生化遗传分析。结果表明,13种同工酶有22个基因位点编码,其中Ldh-1,Me-3,Gdh-1,Sdh-1,G6pd-1和Sod-3共6个位点是多态的,多态位点百分数是27.3%。三疣梭子蟹的平均每个位点的等位基因的有效数目Ae为1.2270,平均每个位点的预期杂合度He为0.1170,实际杂合度Ho为0.2159。同时还分析了三疣梭子蟹的各个多态位点的Hardy-Weinberg偏离指数:Ldh-1、Me-3和Sod-3的d值都为1.0000,Gdh-1、Sdh-1和G6pd-1的d值分别为0.5047、0.8726和0.0597。这些数据表明,莱州湾三疣梭子蟹的种质资源还处于较好的状态。     

基于SSR和ISSR标记对江苏大竹蛏野生群体和人工增殖群体的联合分析

为探索人工增殖活动对本地大竹蛏(Solen grandis)种质资源带来的影响,采用SSR及ISSR分子标记手段对江苏大竹蛏野生群体与人工增殖群体的遗传多样性及遗传结构进行了联合分析。筛选的14对SSR引物扩增获得多态性位点150个(PPB=93.16%),Nei's基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为0.134 2和0.253 5;筛选的10条ISSR引物获得多态性位点85个(PPB=91.93%),Nei's基因多样性指数和平均Shannon信息指数分别为0.131 0和0.230 2。两种方法分析得到野生群体的遗传多样性参数均显著高于人工增殖群体,但两群体间并未产生明显的遗传分化。实验结果表明,江苏沿海大竹蛏群体的遗传多样性水平较高,人工增殖群体的遗传多样性虽有所下降,但并未导致该地区大竹蛏种质资源遗传结构的显著改变。因此人工增养殖活动仍然能够作为补充大竹蛏资源的主要手段,但应探索采用高效生态的增养殖模式,对大竹蛏的种质资源进行合理的开发与利用。     

罗氏沼虾抗病选育群体的抗病性能及其遗传多样性分析

为深入了解罗氏沼虾抗病选育群体的抗病力和遗传信息,通过人工注射溶藻弧菌感染16个罗氏沼虾选育群体,并利用微卫星分子标记对选育群体进行遗传结构分析。结果显示,16个选育群体抗溶藻弧菌感染能力存在明显差别,并从中鉴定出抗病力强的群体3个(SCR11-6、SCR11-11和SCR11-16),其在感染溶藻弧菌感染后的成活率达80%;抗病力比较强的群体7个;抗病力一般的群体4个,成活率为65%～70%;抗病力差的群体2个,成活率为35%～50%。8对微卫星引物共检测到53个等位基因,每对引物的等位基因数为5～9个,平均为6.625个,多态信息含量(PIC)为0.629 4～0.829 4,平均为0.732 3。16个群体的平均PIC为0.493 2～0.695 6,平均观测杂合度为0.506 2～0.651 3,平均期望杂合度为0.551 9～0.733 2,遗传相似系数平均为0.655 2,遗传距离平均为0.434 4。并对DP和SP两群体罗氏沼虾个体扩增出的差异条带进行统计,分析其与罗氏沼虾抗病性状的相关性。结果表明,5个微卫星位点SUGbp8-103b、SUGbp8-101c、MRMB11、SUGbp8-137和MRMC2分别在203、263、185、335和96 bp等位基因与罗氏沼虾抗病性状存在一定的相关性,其中,位点MRMB11在185 bp等位基因跟抗病性有极显著的正相关性,相关系数为0.282。研究表明,16个选育群体中有4个群体的抗病力较强,同时与其它12个选育群体相比,这4个群体遗传多样性也比较丰富,这些罗氏沼虾群体的筛选为罗氏沼虾抗病新品种的培育奠定了重要基础。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。