马业科学网络数据库的建立及其初步应用

通过自编程序建立了以中国马品种资源为主的马业科学网络数据库。并在建立数据库的基础上,初步实现了数据库应用,包括基于Web的文献数据库的网络化查询等。它将为建立马品种资源的科学研究平台打下基础。     

生物信息数据库

近年来大量生物学实验数据的积累 ,形成了当前数以百计的生物信息数据库。它们各自按一定的目标收集和整理生物学实验数据 ,并提供相关的数据查询、数据处理服务。这些数据库大多可以通过网络来访问 ,或者通过网络下载。现就一些主要的、有特色的数据库作一介绍。1　基因和基因组数据库1.1　 Genbank　 Genbank的数据来源于约 5 5 0 0 0个物种 ,包含了所有已知的核酸序列和蛋白质序列 ,以及与它们相关的文献著作和生物学注释。它是由美国国立生物技术信息中心 (NCBI)建立和维护的 ,其数据直接来源于测序工作者提交的序列、由测序中心提交…     

高致病性猪蓝耳病病原核酸的RT-PCR检测

对高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV）Nsp2基因缺失变异特征,设计特异性引物,建立RT—PCR方法,对疑似高致病性猪蓝耳病病例进行病原核酸检测,并对扩增所得片段进行克隆测序,通过序列分析以验证RT—PCR扩增的特异性。结果表明：发病猪为高致病性猪蓝耳病病毒感染,建立的RT-PCR方法能够鉴别诊断经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病感染。     

猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。     

一株猪葡萄球菌的分离鉴定

从患有渗出性皮炎的仔猪分离到1株革兰阳性球菌,生化试验、形态学观察进行初步鉴定,然后进行16 S rRNA基因片段的扩增和测序,将测序结果与GenBank上的已知序列进行同源性比较,结果与猪葡萄球菌的核酸序列同源性达到99.6%,综合可见该分离菌株为猪葡萄球菌,并将其命名为GDSH1。     

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清6型PCR方法的建立及初步应用

为了建立猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清6型分子鉴定方法,本研究根据胸膜肺炎放线杆菌从编码荚膜多糖的碱基序列设计1对引物,扩增特异性的720 bp核酸片段。结果表明,以APP为模板,均能扩增出与预期一致的1条720 bp核酸片段,所得PCR产物经测序,与Gen Bank已发表的胸膜肺炎放线杆菌血清型6型的同源性达99%以上。本研究建立了PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清6型分子鉴定方法,该方法的建立为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌病的诊断和防治及鉴定提供了基础。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

本实验建立猪博卡病毒(PBoV)PCR检测方法,并调查当前云南猪群中PBoV的感染情况。在GenBank数据库中对PBoV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增PBoV非结构蛋白NP1基因片段的引物,基于该引物建立PBoVPCR检测方法;用所建立的方法检测发生腹泻猪的粪便,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;以提取的PCV2、大肠杆菌的DNA为模板验证引物的特异性;并用核酸蛋白定量仪定量PBoV阳性样本的DNA,经梯度稀释后取1μL为模板确定所建立的PBoVPCR方法的敏感性;应用建立的PCR方法调查140份2015年云南省部分猪群样品中PBoV的存在情况。本实验建立的PCR方法特异性强,仅能扩增出PBoV,对PCV2、大肠杆菌核酸无交叉扩增现象;灵敏度高,对PBoV的最低可检出DNA浓度为0.1ng/μL;应用建立的PCR方法检测了140份采集自云南省部分地区的粪便样品,结果显示样本中PBoV的检出率为20%(28/140)。实验成功建立了检测PBoV的PCR方法,对云南地区猪群PBoV的临床诊断和流行病学调查等具有参考价值。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank报道的N基因高度保守核苷酸序列,设计并合成一对引物。上下游引物与Gen Bank中登录的153株猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板,利用SYBR Green I荧光染料法进行RT-PCR扩增,获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照,建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验,变异系数0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证,核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确等优点,可用于临床PEDV的检测及分子流行病学调查。     

《猪常见病图谱数据库》在高职教学中的应用

利用馆藏资源和现代化技术建立《猪常见病图谱数据库》,通过该数据库在相关教学活动中的应用,不仅使教学内容更加生动形象,还在加强学生的自主学习和教学互动方面起到了不可替代的作用。     

从发病仔猪呼吸道检测出猪腺病毒

根据猪腺病毒六邻体保守区域设计两对引物,用Nested-PCR的方法从送检的发病仔猪的呼吸道分泌物中扩增出两个核酸片段.通过基因克隆、序列测定和序列比较,发现这两个核酸片段与猪腺病毒5型和3型的相应片段同源性最高,分别为97.4%和95.3%.证实发病仔猪呼吸道存在猪腺病毒的感染.为下一步猪腺病毒的分离及猪腺病毒表达载体的构建打下基础.     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)感染引起的猪的一种病毒性传染病。文章根据Gen Bank收录的PTV基因序列设计套式引物,建立检测PTV的套式RT-PCR诊断方法;从云南省某猪场疑似猪捷申病的病料中检测出PTV核酸阳性,产物经克隆测序,与Gen Bank收录的PTV毒株序列比对,结果表明该扩增序列与PTV同源性为99%~95%,首次在云南确诊了PTV感染存在。     

银黑狐内皮素受体B基因（EDNRB）的克隆及其组织表达分析

采用RT-PCR方法对银黑狐内皮素受体B基困（EDNRB）进行了克隆,序列分析表明所克隆的cDNA序列全长为1 636bp,包含整个开放阅读框1 332bp,编码443个氨基酸残基。银黑狐EDNRB基因编码序列与GenBank数据库中的犬、猪、人、牛、兔和小鼠的EDNRB基因核酸序列高度同源,同源性分别为99.0%,90.7%,89.5%,89.1%,86.9%和82.8%。银黑狐EDNRB基因编码氨基酸序列中包含1个信号肽序列和7个跨膜区域,跨膜区氨基酸序列在不同物种中高度保守。EDNRB基因组织表达谱分析表明该基因在银黑狐肺、脑和肝脏组织中表达量较高,而在肌肉、脾和心脏中表达量较低,在胃组织中没检测到该基因的表达。本研究结果为下一步探讨ED-NRB基因核酸序列多态性与银黑狐不同毛色表型的相关性奠定了基础。     

RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

根据GenBank发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白S基因的5′端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增的目的片段长度为690bp。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了TGEV的RT-PCR检测方法。     

印第安纳型水疱性口炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据印第安纳型水疱性口炎病毒（VSV）L蛋白的序列，设计了一套特异性引物，建立了检测VSV核酸的一步法RT-PCR方法，并用该法检测了不同的组织样品。结果显示，人工感染VSV小鼠组织检测为阳性，而口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、猪生殖与呼吸综合征等病料检测均为阴性，表明该方法具有较好的特异性。     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应.本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合.以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力.     

四川猪圆环病毒Ⅱ型的检测

据文献资料设计一对引物,初步建立了检测猪圆环病毒II型(PCV-2)核酸片段的PCR方法。从可疑病料中扩增出了预期长度为473bp的DNA片段,用另一套引物证实了PCR产物的特异性。首次证实了四川地区猪群中存在PCV-2感染,为进一步研究打下了基础。     

贵州省某猪场猪瘟病毒感染的诊断

为弄清贵州某猪场猪发病死亡的原因,采用流行病学调查、临床症状观察、病理解剖诊断、猪瘟抗体快速金标检测卡检测和RT-PCR检测核酸确诊等方法,对该猪场发病猪进行了诊断。实验结果表明:流行病学调查、剖检病理和猪瘟抗体快速金标检测卡检测初步诊断该猪场发病猪疑似猪瘟病毒感染,RT-PCR检测核酸确诊为猪瘟病毒野毒感染。     

巢式RT-PCR在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用

建立对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的巢式RT-PCR(RT-nested PCR)检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供更为可靠和敏感的手段。根据GenBank中收录的TGEV,纤突蛋白S基因的核酸序列设计了2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR、RT-nested PCR方法,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的RT-nested PCR诊断方法。试验结果成功扩增出长度为886 bp和690 bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。表明RT-nested PCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此法简单省时、灵敏性高。