鳜传染性脾肾坏死病毒核糖核酸酶III基因结构及序列分析

测定了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)核糖核酸酶III(RNaseIII)基因的核苷酸全序列。该基因完整读码框为 771bp ,GC含量为 5 2 .5 3% ,编码一个长为 2 5 6个氨基酸、分子量为 2 8.9kD的推定蛋白。其上下游序列各有一个TATAbox ,终止子下游有一段回文序列。与其它物种相比 ,ISKNV与虹彩病毒 (包括LCDV - 1和CIV)的核糖核酸酶III基因的氨基酸序列同源性较高 ,与酵母、线虫等物种的相应基因的同源性较低     

鳜传染性脾肾坏死病毒p31基因结构及序列分析

报道了鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的p31基因结构及其序列分析。对ISKNV DNA HindⅢE酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的p31基因，ISKNV p31基因完整读码框为675bp，GC含量为49.78%，等电点为7.61，编码一个长为225aa、分子量为25.3kD的推定蛋白。结果分析发现该基因具有启动动子TATAbox和CAATmotif，下游有反向重复序列可形成茎环，另外还有一段直接重复序列和二联体结构。ISKNV与其它3种虹彩病毒（包括FV3、LCDV－1和EHNV）的p31基因氨基酸序列具有一定的同源性，但ISKNV与它们的同源性不高，序列比较和系统树分析发现ISKNV与蛙病毒属和淋巴囊肿病毒属的病毒都不尽相同。     

鳜传染性脾肾坏死病毒的纯化和酶切分析

鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原，本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ISKNV病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为150mm，抽提病毒核酸，对其基因组DNA进行酶切分析，病毒基因组为双链DNA分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶5′端高度甲基化，以限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindⅢ、KpnI和PstI酶切ISKNV基因组DNA，经电泳分离后，分别得到1、8、9、18、22条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过108.7kbp。     

编码鳜传染性脾肾坏死病毒结构蛋白新基因ORF90.5L的鉴定分析

鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidhey necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111 362 bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF).21307年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(core gene)ORF90.5L.本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963 bp的PCR产物.该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35 kD,含有预测的跨膜区,与虹彩病毒属(Iridovirus)其他成员编码的肉豆蔻基膜蛋白有较高的同源性.将该片段克隆到原核表达载体pET32a(+)中,纯化表达的重组蛋白pET90.5L免疫昆明鼠获得高效价多克隆抗体.利用抗pET90.5L抗体与纯化病毒进行免疫印迹,结果表明,抗pET90.5L的多抗可以特异性识别病毒粒子中大小约为35 kD的蛋白条带,ORF90.5L编码的蛋白应为病毒的结构蛋白.本研究旨在为ISKNV基因工程疫苗的研发和病源侵染机制研究提供基础参考.     

鳜鱼脾肾坏死病毒功能基因研究

鳜鱼脾肾坏死病毒（ISKNV）是引起养殖鳜鱼大量死亡的传染性疾病的病原体,经研究证实其为虹彩病毒科中的一种.概括了近年国内外有关鳜鱼脾肾坏死病毒分子生物学的研究进展,重点论述了病毒功能基因及调控的相关研究,同时介绍了目前采用的几种特异的病毒检测方法,并指出其各自的优缺点.     

传染性脾肾坏死病毒感染鳜Siniperca chuatsi的组织病理学观察

对经分子生物学手段检测出感染了传染性脾肾坏死病毒鳜Siniperca chuatsi组织进行病理学观察。结果发现:患病鳜(1)造血器官严重坏死:以脾脏最为严重,脾细胞正在坏死或已坏死,细胞稀疏;头肾和肾的淋巴样组织坏死次之;(2)主要器官血管壁组织坏死:脾、肝、头肾、肾的大血管均坏死;(3)组织淤血、出血:肠、肠系膜、性腺、肝脏等部位呈现不同程度的淤血、出血;(4)在各器官出现数量不一的肿大细胞:以脾脏中最多。     

巢式PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)

鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是鳜暴发性传染病的主要病原,给鳜养殖业造成了严重的经济损失,因此快速、灵敏的检测方法对鳜养殖业的发展具有非常重要的意义.根据鳜ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了2对引物,利用巢式PCR方法对病鱼脾肾组织进行扩增,建立了ISKNV快速特异的巢式PCR检测方法.应用该方法对含MCP基因的质粒进行倍比稀释后检测扩增的灵敏度可达到5 fg;巢式PCR检测的灵敏度是一步法PCR的104倍以上.     

鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。     

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。     

基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法

针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。     

传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的影响研究

为探究接种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的组成结构及相关功能基因的影响,对体质量(20±1.8) g的鳜进行腹腔注射传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗,对照组注射等体积无菌生理盐水。对照组和免疫组放入用纱网隔开的同一池塘中养殖,28 d后每组各采集10尾肠道粪便样本,用高通量测序,构建文库。高通量测序共获得9669条序列,平均长度为543 bp。Alpha多样性分析结果显示,Chao1指数在对照组中更高,香农指数和辛普森指数在免疫组中更高,表明免疫后肠道微生物的多样性和丰度增加。在门水平上,对照组肠道微生物以变形菌门为优势菌门,相对丰度为72.23%;免疫组以变形菌门和衣原体门为优势菌门,相对丰度分别为28.57%和11.13%。在属水平上,对照组以气单胞菌属为主要优势属,相对丰度高达71.73%;免疫组以衣原体属和埃希氏杆菌属为主要优势属,相对丰度分别为11.57%和8.7%。免疫组与对照组相比,共筛选到9656个差异丰度基因,其中有840个基因高丰度,8816个基因低丰度。差异基因主要富集在双组分系统、ABC转运子、嘌呤代谢、群体感应、细菌趋药性、鞭毛组装和细菌分泌系统等通路,通...     

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证

将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg,尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS).结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50 ug/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50 μg/尾免疫组及100 μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50 μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48 h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%.研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好.     

传染性脾肾坏死病毒_ConA和L_省略_对体外鳜的头肾淋巴细胞转化的影响

采用MTT颜色反应法研究传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、伴刀豆球蛋白A（concanavallin A,ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS）在离体状态下对健康和ISKNV感染后存活30d或60d的鳜的头肾淋巴细胞转化的影响。结果表明，ConA和LPS能促进健康鳜头肾淋巴细胞的转化，而对感染后存活30d或60d的鳜头肾淋巴细胞没有作用；纯化的ISKNV对健康鳜头肾淋巴细胞没有促进淋巴细胞转化的作用，但对ConA的作用有抑制，对感染后存活的30d或60d的鳜头肾淋巴细胞，纯化的ISKNV有一定的促进转化的作用，感染存活的鳜头肾中有对ISKNV的免疫记忆性T细胞。另外，用建立的ISKNV PCR检测方法对健康和ISKNV感染后存活的鲜组织进行了检测，结果显示，健康鳜为阴性，而ISKNV感染后存活的鱼，头肾、后肾、脾脏和部分鱼的心脏为阳性。ISKNV在鳜体内形成潜伏感染。     

鳜亲环蛋白A在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

为研究鳜亲环蛋白(CypA)在传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)感染中的作用,通过RT-PCR克隆了CypA全长开放读码框(SC-CypA)。结果表明SC-CypA基因全长495 bp,编码164个氨基酸,分子量为17.59 ku。通过Blast比对和同源性进化分析,发现其与人、鼠、原鸡和斑点鲖等物种的CypA具有高度相似性,表明SC-CypA属于CypA家族的成员。环孢素A(CsA)具有免疫抑制作用,是CypA的抑制剂。结果发现,CsA浓度与ISKNV增殖具有一定的剂量依赖关系;CsA作用不同时间对ISKNV均有抑制效果;CsA对ISKNV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用,能抑制IL-1β、IL-8、IL-18和ISG15的表达。研究表明,宿主的CypA对ISKNV的增殖起着重要的作用,通过添加其抑制剂CsA能有效抑制病毒的增殖。     

鳜SIRT3蛋白在传染性脾肾坏死病毒感染中的作用

沉默交配型信息调节因子2同源蛋白3 (silent mating type information regulation 2 homolog 3,SIRT3)是一种去乙酰化酶,可调节线粒体氧化代谢.为探讨鳜(Siniperca chuatsi) SIRT3在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and...     

传染性脾肾坏死病毒、ConA和LPS对体外鳜的头贤淋巴细胞转化的影响

采用MTT颜色反应法研究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、伴刀豆球蛋白A(concanavallin A,ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在离体状态下对健康和ISKNV感染后存活30d或60d的鳜的头肾淋巴细胞转化的影响.结果表明,ConA和LPS能促进健康鳜头肾淋巴细胞的转化,而对感染后存活30d或60d的鳜头肾淋巴细胞没有作用;纯化的ISKNV对健康鳜头肾淋巴细胞没有促进淋巴细胞转化的作用,但对ConA的作用有抑制,对感染后存活的30d或60d的鳜头肾淋巴细胞,纯化的ISKNV有一定的促进转化的作用.感染存活的鳜头肾中有对ISKNV的免疫记忆性T细胞.另外,用建立的ISKNV PCR检测方法对健康和ISKNV感染后存活的鳜组织进行了检测,结果显示,健康鳜为阴性,而ISKNV感染后存活的鱼,头肾、后肾、脾脏和部分鱼的心脏为阳性.ISKNV在鳜体内形成潜伏感染.     

超分支滚环扩增法检测传染性脾肾坏死病毒

用超分支滚环扩增法检出传染性脾肾坏死病毒。超分支滚环扩增法包括锁式探针的连接及超分支滚环扩增法扩增两部分,通过研究锁式探针的最佳连接体系和连接条件,并进行超分支滚环扩增法反应条件的优化,得出的本研究最适反应条件为:锁式探针在T4 DNA连接酶作用下37℃连接20 min,接下来的超分支滚环扩增法在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应40 min,即能够实现靶序列的有效检出。灵敏度试验表明,超分支滚环扩增法所能检测到的最低模板量接近1 copy。在4种病毒中进行的特异性试验表明,本方法能够保证对传染性脾肾坏死病的特异性检测。     

同步接毒条件下鳜传染性脾肾坏死病毒在CPB细胞中的最适增殖条件

为了获知鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)同步接毒最适增殖条件,通过检测不同血清浓度、病毒接种量、细胞状态等培养条件下的病毒拷贝数,确定鳜脑组织细胞(CPB)同步接种ISKNV的最适体外增殖条件。结果表明,上述各因素对ISKNV的增殖量均有明显影响。其中选取处于对数生长中期的CPB细胞,胰酶消化后按照病毒感染复数(MOI)为0.2同步接种ISKNV,培养液中胎牛血清终浓度为6%时,28℃恒温培养9 d后收获,所得病毒拷贝数最多,为2.54×10⁸拷贝/mL。将所测得病毒拷贝数折算成培养基成本进一步分析表明,按照上述相同条件进行接毒,每元人民币培养基所得病毒量也最高,为4.24×10¹¹拷贝。综上所述,本研究基于病毒增殖量及培养基成本对病毒增殖条件进行优化,可为低成本ISKNV疫苗的生产提供理论依据。     

基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验方法建立及其应用

为建立传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经q RT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒p MDORF099为标准品,采用q PCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=–3.42lgx+39.455,最低检测限为3拷贝/μL,结果显示组间和组内变异系数均小于2%,表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释成100~103拷贝/m L,分别取1 m L病毒稀释液接种CPB细胞,在第7、9和11天提取细胞总RNA,经基因组DNA去除试剂盒去除残留DNA后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转录本,结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。将3个浓度梯度(0.05%、0.1%、0.2%)的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品接种CPB细胞9 d,采用上述快速检验方法进行检测。0.05%、0.1%甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本,其他样品均未检测到。而细胞盲传实验显示,0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE,鱼体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡,表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度,与传统检测方法相比具有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点,对提高ISKNV灭活疫苗生产效率具有重要意义。     

山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析

2008年11月～2010年11月,采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批,按照世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral Disease,RSIVD)进行初步调查.结果显示,共检出4例RSIVD感染样品.以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus,RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)主要衣壳蛋白基因为基础,设计简并引物,PCR扩增本次检出阳性样品的RSIV/ISKNV MCP基因.将MCP基因PCR扩增产物测序,提交GenBank,并以MCP基因为基础,对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系统分类,绘制进化树.由进化树得出,4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属.