点带石斑鱼致病性哈维氏弧菌的分离鉴定及药敏试验

为探究养殖点带石斑鱼死亡原因,从患病点带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏中分离得到一株细菌,命名为SBY-G.经形态学观察、生理生化试验鉴定,初步判定为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi).16S rDNA基因序列分析显示,菌株SBY-G与哈维氏弧菌菌株(KU364055.1)相似性最高,g...     

三北地区鱼源气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

选取三北地区鲤、鲫、草鱼、大西洋鲑等鱼体内分离到的气单胞菌共16株,结合革兰氏染色、氧化酶反应和分子生物学方法对其进行鉴定后,采用K-B药敏纸片法测定16株菌对10类25种药物的敏感性。结果表明:16株菌均为革兰氏阴性、氧化酶阳性细菌;Blast比对分析发现实验菌株的16S rRNA序列分别与Gen Bank数据库中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株的16S rRNA基因序列同源性较高,相似性达95%以上;系统发育树显示16株菌分别与维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株聚为一支,而与肠杆菌、志贺菌和弧菌分支较远,从而判定为维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌;16株分离菌中有3株维氏气单胞菌、4株嗜水气单胞菌、3株温和气单胞菌和6株杀鲑气单胞菌;药敏试验中16株气单胞菌对氨苄西林、青霉素G、阿莫西林、三甲氧苄氨啶、复方新诺明、磺胺异噁唑、氯霉素、利福平具有较高的耐药性,耐药率达95%以上,对氟喹诺酮类药物普遍较敏感,不同菌株之间的耐药谱存在很大差异。为气单胞菌的鉴定及三北地区淡水鱼细菌病的药物防治提供科学依据。     

海水养殖斜带石斑鱼致病性鳗弧菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]了解海水养殖斜带石斑鱼弧菌病的病原,为生产中有效防治石斑鱼弧菌病提供科学依据.[方法]采用常规方法进行患病斜带石斑鱼病原菌分离,人工感染试验确定其致病性,以形态学观察、生理生化测试结合16SrRNA和gyrB基因序列分析等方法进行菌株鉴定,并以K-B纸片扩散法进行药敏试验.[结果]从广东省湛江市某养殖场患病斜带石斑鱼中分离获得l株优势菌株(M1),经人工感染试验证实其对斜带石斑鱼具有较强的致病性.M1菌株的16S rRNA序列和gyrB基因序列与GenBank数据库中的鳗弧菌具有较高相似性,其同源性均在95.7%以上.根据M1菌株的形态特征、生理生化特性及分子特征,可鉴定其属于弧菌属的鳗弧菌(Vibrio anguillarum).药敏试验结果显示,M1菌株对庆大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、诺氟沙星和左氟沙星等7种药物高度敏感,对阿洛西林、强力霉素、链霉素、复方新诺明和甲氧苄啶等14种药物敏感.[结论]引起广东省湛江市某养殖场海水养殖患病斜带石斑鱼弧菌病的病原菌为弧菌属鳗弧菌,生产中可适度选用氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明和甲氧苄啶等抗菌药物进行防治.     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

刺参表皮溃烂病病原菌的分离鉴定与药敏试验

为了确定刺参表皮溃烂病的病原菌,从山东省烟台和日照两个地区人工饲养的刺参中挑取具有明显症状的幼参,从体表病灶和体内组织中共分离得到15株细菌,利用人工感染试验、细菌形态观察及生理生化试验对其进行了鉴定。结果表明,引起山东省日照地区养殖场刺参表皮溃烂病的病原菌R-2为杀鲑气单胞菌(Aeromonas.salmonida);烟台地区养殖场的病原菌Y-1为中间气单胞菌(Aeromonas.media),Y-8为弧菌属的海弧菌生物变种I(Vibro.pelagius biovarI)。药敏试验结果表明,R-2对蒽诺沙星、氟苯尼考、硫酸庆大霉素敏感,对氧氟沙星、硫酸阿米卡星等8种抗生素不敏感;Y-1和Y-8仅对氟苯尼考敏感。     

大西洋鲑腐皮病研究——鳃部病原菌的分离鉴定

从发生腐皮病死亡的大西洋鲑的腮部分离、培养出细菌15株。用腹腔接种法进行动物实验,15株菌中有5株菌确定为致病菌,可引起试验鱼60％-100％的死亡;对分离出的5株致病菌经过形态、染色特性和培养特性观察以及生理生化鉴定得出杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、温和气单胞菌Aeromonas sobria）及无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）等的结论。     

虹鳟致病性杀鲑气单胞菌的分离鉴定及其毒力因子的检测

为研究虹鳟Oncorhynchus mykiss致病性杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida的致病机理,利用微生物学及分子生物学方法,从患皮肤溃疡病的虹鳟病灶处分离纯化获得1株优势菌株RBWF-1,通过人工感染试验证实其具有较强的致病性。结果表明:菌株RBWF-1对虹鳟的半致死浓度(LD50)为5.5×10~6CFU/m L;通过对菌株RBWF-1 16S r DNA基因序列扩增、测序及Blast对比,发现其与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Asalmonicida subsp.masoucida菌株NBRC 13748及无色亚种A.salmonicida subsp.achromogens菌株NCIMB 1110的16S rDNA基因序列同源性最高,一致性均为99.6%;构建系统发育树显示,菌株RBWF-1与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.salmonicida subsp.salmonicida、杀日本鲑亚种、无色亚种和史氏亚种A.salmonicida subsp.smithia聚为一支;为进一步明确菌株的分类地位,利用Biolog微生物鉴定系统结合传统生理生化试验对菌株RBWF-1各项理化指标进行检测,经对比,与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种吻合度最高,因而判断该分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种;同时,对分离菌株的气溶素、溶血素、封闭带毒素、DNA酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、S层蛋白7个毒力相关基因进行了PCR检测,检测结果均呈阳性;酶活性检测结果显示,菌株RBWF-1胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶和溶血活性。本研究结果可为中国虹鳟养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、分类鉴定和疫苗研制提供必要的数据和参考。     

噁喹酸在健康和染病石斑鱼体内代谢规律比较

建立石斑鱼哈维氏弧菌人工感染模型,比较噁喹酸在健康和感染石斑鱼体内的药代动力学特征,结果显示,哈维氏弧菌腹腔注射感染对石斑鱼的半致死量(LD₅₀)为1.2×10⁵ g^-1鱼体重,在20 mg·kg^-1肌肉注射给药剂量下血药达峰时间从健康时的0.5 h延迟为感染时的1.0 h,达峰浓度从15.58 mg·L^-1降低为11.32 mg·L^-1,消除半衰期从26.451 h延长为55.247 h,血药浓度时间曲线下面积从351.625 mg·h^-1·L^-1减小为336.470 mg·h^-1·L^-1,这些结果表明感染哈维氏弧菌影响了石斑鱼对噁喹酸的吸收与代谢。11株哈维氏弧菌对噁喹酸的体外药敏实验结果显示,最低抑菌浓度(MIC)为0.5~2.0 mol·L^-1,表明哈维氏弧菌对噁喹酸的敏感性存在一定差异,但整体而言其MIC较低。药动学和体外药效试验结果表明,石斑鱼在哈维氏弧菌感染情况下采用20 mg·kg^-1体质量噁喹酸给药剂量其C_max/MIC>8,可达到较有效的治疗效果。     

青蛤体内细菌菌群组成及致病性弧菌的初步调查

青蛤样品体内需氧平板菌落数为0．16×105～5.7×105个／克。从青蛤体内共分离到168株细菌,大多是革兰氏阴性杆菌。优势菌属是莫拉氏菌属（Moraxella）71株、弧菌属（Vibrio）33株、假单胞菌属（Pseudomonas）19株、气单胞菌属（Aeromonas）16株、其次是微球菌属（Micrococcus）6株、不动细菌属（Acinetobacter）3株和芽抱杆菌属（Bacillus）2株,还有未能鉴定到属的革兰氏阴性杆菌（11株）及传代中死亡的菌株（7株）等。弧菌是海产动物的主要致病菌,可引起蛤类和牡蛎幼体、成体的大批死亡。在青蛤体内共检得弧菌33株,溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）15株、创伤弧菌（Vvulnificus）9株、拟态弧菌（V．mimicus）2株和河弧菌（V．fluvialis）1株、弧菌I（VibrioI）4株、弧菌Ⅱ（VibrioⅡ）2株。上述弧菌在夏季分离到,冬季未检出,这些弧菌也是人的致病菌,在夏季人们如食用了生的或未经煮熟的青蛤,易发生食物中毒,应予以重视。     

青蛤体内细菌菌群组成及致病性弧菌的初步调查

青蛤样品体内需氧平板菌落数为0．16×105～5.7×105个／克。从青蛤体内共分离到168株细菌,大多是革兰氏阴性杆菌。优势菌属是莫拉氏菌属（Moraxella）71株、弧菌属（Vibrio）33株、假单胞菌属（Pseudomonas）19株、气单胞菌属（Aeromonas）16株、其次是微球菌属（Micrococcus）6株、不动细菌属（Acinetobacter）3株和芽抱杆菌属（Bacillus）2株,还有未能鉴定到属的革兰氏阴性杆菌（11株）及传代中死亡的菌株（7株）等。弧菌是海产动物的主要致病菌,可引起蛤类和牡蛎幼体、成体的大批死亡。在青蛤体内共检得弧菌33株,溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）15株、创伤弧菌（Vvulnificus）9株、拟态弧菌（V．mimicus）2株和河弧菌（V．fluvialis）1株、弧菌I（VibrioI）4株、弧菌Ⅱ（VibrioⅡ）2株。上述弧菌在夏季分离到,冬季未检出,这些弧菌也是人的致病菌,在夏季人们如食用了生的或未经煮熟的青蛤,易发生食物中毒,应予以重视。     

哈维弧菌及其主要致病因子的研究进展

哈维弧菌作为水产养殖中重要的致病菌,近十多年得到了广泛研究。就哈维弧菌的危害对象和发病症状进行了概述,归纳了该病致病因子的研究进展,并总结了目前哈维弧菌的检测技术和防治方法,以期为哈维弧菌致病机理的进一步深入研究提供参考和借鉴。     

灰额刺尾鱼溃疡病病原分离及鉴定

从灰额刺尾鱼(Acanthurus glaucopareius)体表溃烂处及内脏器官中分离到5株较强致病力的菌株,经过人工感染健康鱼证实该菌株是致病菌。对该病原菌进行了形态、生理生化反应测试,结果显示为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。应用细菌16S rDNA的通用引物对该菌基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1 392 bp的核苷酸序列,该序列与溶藻弧菌(登录号GQ455008)的16S rDNA基因序列同源性达99%,进一步确定该致病菌为溶藻弧菌。药敏试验结果表明,该菌株对痢特灵、氟哌酸、环丙沙星等药物敏感,对甲氧胺嘧啶、氨苄青霉素、阿米卡星、青霉素等药物耐药。研究亮点:通过系统的病原学试验研究,证实了灰额刺尾鱼溃疡病的病原为溶藻弧菌,并验证了该病原菌的药物敏感性等特性,以及对该病的病症、病因及临床治疗方法进行了分析,这些结论尚属首次报道,为灰额刺尾鱼溃疡病以及其他海水观赏鱼同类疾病的临床诊断和防治技术提供科学依据。     

文蛤生物体及内脏中弧菌的研究

[目的]鉴定文蛤体内弧菌的类型及致病性强度,并筛选治疗这些病原菌的最佳药物。[方法]用TCBS培养基从文蛤生物体内分离出12株弧菌,对其进行致病性试验,对致病性较强的3株弧菌进行鉴定及药物敏感试验。[结果]该3株菌分别为河流弧菌H04（Vibrio fluvialis）,H06副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）,H11创伤弧菌（Vibrio vulnificus）,其对环丙沙星、先锋赛高度敏感,对青霉素G、先锋霉素V有耐药性,临床上可以首选环丙沙星、先锋赛作为治疗这些病原菌的药物,其次是头孢曲松、氟哌酸、丁胺卡那、四环素、庆大霉素等。[结论]结果为文蛤疾病的防治提供了理论依据。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

福建南部养殖石斑鱼暴发性疾病流行调查

近年来福建南部网箱养殖石斑鱼常暴发急性传染病,经试验确认的传染病病原有神经坏死病毒、微孢子虫、本尼登虫以及多种弧菌.由神经坏死病毒引起的病毒性神经坏死病表现典型的神经症状,中枢神经组织和视网膜细胞严重空泡坏死;微孢子虫病表现为腹部、生殖腺、肝脏、肌肉等组织寄生大量孢子囊;本尼登虫主要寄生于石斑鱼的体表;感染的细菌主要有溶藻弧菌、副溶血弧菌以及河流弧菌等10种,这些菌多为条件致病菌.调查结果表明,病毒性神经坏死病是该地区养殖石斑鱼最常见危害也最大的传染病.     

哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系

采用不同血清型哈维氏弧菌Vibrio hanwyi624、809和106等3个菌株，制备成福尔马林灭活菌苗，注射接种大黄鱼4周后，通过血清中凝集、交叉凝集抗体效价测定以及活菌攻毒试验，证明了3个菌株制备的菌苗抗原性存在差异。     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明：通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

中国南部养殖石斑鱼“肿胀病”的研究

1998年5月至7月间,在中国南部养殖石斑鱼暴发"肿胀病",引起石斑鱼大量发病、死亡.从体表和鳍条的溃疡病灶处分离出2个菌株.形态学观察和生化试验结果表明这2个菌株均为鳗弧菌.将肝、脾、心和肾的上清液接种到CO、FHM、CAB、CK、PG和PC细胞上,没有观察到细胞病变.患病鱼的腹腔中有大量黑色的球状物和腹水,使患病鱼呈现明显的腹部肿胀的症状.组织病理学观察结果表明,这些黑色的球状物由多核细胞组成的增生性组织.     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

养殖大菱鲆腹水病病原菌的分离与鉴定

[目的]从养殖大菱鲆中分离腹水病病原菌,并对其进行鉴定。[方法]从山东半岛2个不同的养殖场腹水病发病大菱鲆体内分离病原菌,并通过常规生理生化试验和16S r DNA基因序列对比对其进行鉴定。[结果]共分离到2株优势细菌。常规生理生化特征分析表明,这2株菌分别与鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表性特征非常相似。系统发育树分析表明这2株菌与鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的亲缘关系最近。[结论]这2株细菌被鉴定为鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。