绵羊味觉受体第一家族基因外显子多态性分析

为了探讨绵羊味觉受体第一家族（taste receptor family 1 member,T1R）基因外显子多态性及其基因型在乌珠穆沁羊和湖羊群体中分布的差异性,试验采用DNA池直接测序及飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）法对中国蒙古系两个绵羊品种共172个个体T1Rs基因外显子的遗传变异情况进行分析,利用生物信息学软件预测多态位点对T1Rs基因mRNA二级结构和蛋白质二级结构的影响。结果表明,在两个群体的T1R家族基因中筛查到9个SNPs。独立性卡方检验显示有5个多态位点基因型的分布在两个绵羊群体中存在显著性差异（P<0.05）,分别为TAS1R1基因上的SNP2,TAS1R2基因上的SNP4、SNP7和SNP8,TAS1R3上的SNP10,其中,SNP2、SNP7和SNP10为同义突变;SNP2和SNP10导致相应基因mRNA二级结构和最小自由能的改变,而SNP7仅导致TAS1R2基因最小自由能发生改变;SNP4和SNP8为错义突变,分别导致TAS1R2蛋白质中第379位天冬酰胺变为丝氨酸和第701位苏氨酸变成蛋氨酸,且突变前后受体蛋白的二级结构均发生改变。     

绵羊雌激素受体基因外显子4多态性分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR SSCP技术分析ESR基因外显子4在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（特克塞尔、中国美利奴、考力代和杜泊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,ESR基因的此对引物扩增片段在所检测的6个绵羊品种中均不存在PCR SSCP多态性,说明所检测的ESR基因外显子4序列比较保守,该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

洼地绵羊MHC-DRB1基因PCR-RFLP多态性分析

为了探讨洼地绵羊MHC-DRB1基因的多态性,采用套式PCR扩增82只洼地绵羊的MHC-DRB1基因第2外显子,其296 bp扩增产物经Sac Ⅰ、Hae Ⅲ限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析.结果表明,洼地绵羊的MHC-DRB1基因外显子2在Sac Ⅰ、Hae Ⅲ的酶切位点存在多态性,测序发现,这些酶切位点分别...     

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。     

绵羊孕酮受体基因的PCR-SSCP分析

作者设计3对引物,采用PCR-SSCP方法检测孕酮受体（progesterone receptor,PGR）基因DNA结合区和配体结合区序列在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特和特克赛尔）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对绵羊繁殖力的影响;对小尾寒羊PGR基因外显子5、6和9克隆测序,结合GenBank提供的绵羊PGR基因部分编码序列,拼接出绵羊PGR基因DNA结合区和配体结合区的完整序列,推导出编码的氨基酸序列;并将人、兔、狗、绵羊、小鼠和大鼠的PGR基因这两个区域的核苷酸与氨基酸序列进行比较。结果表明,PGR基因DNA结合区和配体结合区序列在所检测的4个绵羊品种中都不存在单核苷酸多态性;人、兔、狗、绵羊、小鼠、大鼠PGR基因DNA结合区和配体结合区的核苷酸序列同源性分别为88.6%~97.2%和84.4%~96.3%,氨基酸序列同源性分别为97.6%~100%和96.3%~99.6%。可见,哺乳动物PGR基因DNA结合区和配体结合区序列保守性很强,这两个区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

6个绵羊群体骨形态蛋白受体1B基因多态性分析

试验旨在分析6个绵羊群体骨形态蛋白受体1B（bone morphogenetic protein receptor-1B,BMPR-1B）基因多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。采集新吉细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、东北细毛羊、杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊6个绵羊群体共381只个体的血样,通过PCR-RFLP技术检测BMPR-1B基因多态性,并用DNAStar软件预测蛋白质二级结构,利用Excel 2003软件计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡,以及遗传多样性参数（杂合度（He）、纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC））。结果显示,新吉细毛羊、东北细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、白头杜泊羊BMPR-1B基因均不存在多态性;杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）具有多态性,存在3种基因型：++、B+和BB。杜×寒杂交羊（F1）χ²值达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态;杜×寒杂交羊（F3）χ²值未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态。杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）的PIC分别为0.311和0.264,为中度多态。推测BMPR-1B基因不是新吉细毛羊、东北细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、白头杜泊羊4个绵羊群体多胎性状的主效基因,但可作为杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）多胎性状的主效基因。     

4个绵羊品种LHCGR基因单核苷酸多态性分析

为探究绵羊LHCGR基因在4个绵羊品种之间的多态性与基因功能,本研究以杜泊羊、滩羊、小尾寒羊、滩羊和小尾寒羊杂交羊4个绵羊品种为研究对象,利用Sequenom MassARRAYSNP技术对4个绵羊品种LHCGR基因g.75747421A>C、g.75748200T>A 2个位点进行检测,并利用相关生物信息学软件预测分析2个位点突变前后mRNA二级结构与其编码蛋白的理化性质、结构和蛋白互作等。结果表明,LHCGR基因g.75747421A>C位点在4个品种中存在3种基因型,分别是CC、CA和AA;g.75748200T>A位点在4个品种中存在AA、AT和TT 3种基因型;χ²适合性检验表明,g.75747421A>C、g.75748200T>A 2个位点在4个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的相对分子质量为73 599.70,理论等电点为8.30,脂肪系数为98.90,总平均亲水性为0.191,推测该蛋白为疏水性蛋白;突变前后LHCGR基因的mRNA二级结构、编码蛋白二级结构及三级结构均发生了变化;蛋白互作的结果表明,与LHCGR蛋白相互作用的蛋白质主要包括骨形态发生蛋白15（BMP15）、嗜铬粒蛋白A （CGA）、甲羟戊酸激酶（MVK）、胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基（GNAS）等。本研究成功筛选出4个绵羊品种LHCGR基因多态位点,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据。     

绵羊催乳素受体基因外显子10多态性及其与产羔数相关分析

采用PCR-SSCP技术检测催乳素受体(PRLR)基因外显子10在湖羊、小尾寒羊、洼地羊和阿勒泰羊中的单核苷酸多态性,研究该基因与湖羊高繁殖力的关联性。结果表明:4个绵羊品种在P2引物扩增区域均符合Hardy-Wenberg平衡,但P3引物只有阿勒泰羊符合Hardy-Wenberg平衡。P2扩增片段的不同基因型分布频率在4个品种间差异不显著(P0.05);而除阿勒泰羊P3扩增片段的基因型分布与其余3个品种间存在极显著差异(P0.01)外,其余各品种间基因型分布差异不显著(P0.05)。4个绵羊品种间产羔数存在极显著差异(P0.01),但不同基因型间产羔数差异不显著(P0.05);湖羊不同引物不同基因型产羔数的差异亦均不显著(P0.05)。本研究表明,PRLR基因不能作为湖羊高繁殖力的候选基因。     

不同繁殖力绵羊BMPR-IB基因CDS区597位点多态性检测

为探究骨形态发生受体蛋白IB基因(Bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB)编码区多态性对绵羊繁殖性能的遗传效应,以湖羊、产单羔蒙古羊、产双羔蒙古羊、产单羔欧拉羊、产双羔欧拉羊母羊为研究对象,对试验群体的BMPR-IB基因CDS区597位点进行了多态性检测.结果显示:...     

绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性分析

试验旨在探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）基因在绵羊中的遗传多态性,并寻找可用于辅助选择的分子标记。本研究以滩羊（250只）及滩羊×湖羊杂交F1代（174只）为试验动物,利用SNaPshot分型技术对H-FABP基因（GenBank登录号：AY157617）的多态位点进行单核苷酸多态性（SNP）分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体重、体长、体高、胸围、胸深、胸宽和管围等生长性状的关联性。结果显示：①检测到9个多态位点：939[A/G]、980[G/A]、1018[T/C]、2878[C/T]、2956[C/T]、3017[G/A]、3341[G/C]、3394[T/A]、1056[-/G],其中有6处转换、2处颠换、1处单碱基插入。②939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]和1018[T/C]的He为0.3200~0.4666,PIC为0.2688~0.3577;2878[C/T]、3017[G/A]位点的He为0.0283~0.1272,PIC为0.0279~0.1191,为低度多态;1056[-/G]位点的He在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中分别为0.0120和0,PIC在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中分别为0.0119和0;9个多态位点在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中均符合Hardy-Weinberg平衡定律。③5个多态位点：939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]处于紧密连锁（D'>0.99）,将H-FABP基因分为3个单倍型：AA、AB和BB。④在41只滩羊×湖羊杂交F1代羊中,BB单倍型在各生产性状上具有最大值,但各单倍型间差异不显著（P>0.05）。结果表明,绵羊H-FABP基因具有丰富的遗传多态性,939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]5个位点紧密连锁,BB单倍型可能是与绵羊生产性状相关的优势单倍型。     

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究

为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示：武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型,基因型频率分别为0.9167、0.0833;第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型,基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明,武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269 bp发生了A→G的突变,第2外显子在41 bp发生了C→T的突变,二者均属于同义突变。统计结果表明,武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子呈低度多态,第2外显子呈中度多态,外显子3没有发生突变。     

策勒黑羊BMPR-IB基因多态性研究

以影响布鲁拉美利奴羊繁殖力的骨形态发生蛋白受体-IB (bone morpho-genetic protein receptor-IB, BMPR-IB) 基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法对策勒黑羊中BMPR-IB基因的多态性进行了研究。结果表明,在随机选取的100只策勒黑羊中检测到BB、B+和++ 3种基因型,其中BB、B+、++基因型频率分别为0.10、0.43和0.47,B基因频率为0.315,+基因频率为0.685,处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。推测BMPR-IB基因可能是影响策勒黑羊多羔性状的候选基因之一。     

多浪羊MHC-DRB1基因多态性与包虫病抗性分析

通过PCR扩增122只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和70只包虫病阳性多浪羊的MHC -DRB1第2外显子,产物经SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ3种限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析.结果表明,多浪羊MHC-DRB1基因第2外显子在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切位点存在丰富的多态性,分别检测出了2、2和6种等位基因,出现了3、3和18种基因型.将包虫病阴性和阳性多浪羊的等位基因频率和基因型频率分别进行比较分析,发现等位基因HaeⅢ a对包虫病感染具有一定的易感性(P＜0.05),SacⅠab和Hin1Ⅰaa 2个基因型对包虫病具有一定的抗性(P＜0.05), HaeⅢbe和HaeⅢef这2个基因型对包虫病具有较强的易感性(P＜0.01).     

猪红细胞生成素受体基因外显子区多态性研究

研究以5头北京黑猪和5头东北民猪DNA混合池为模板,采用测序的方法研究猪红细胞生成素受体（erythropoietin receptor,EPOR）基因外显子区序列遗传变异。研究结果发现,EPOR基因外显子区共存在3个SNP位点,其中g.1147C＞G位于外显子2,可导致第50位氨基酸改变（Leu＞Val）;g.1645G＞A位于外显子3,可导致第92位氨基酸改变（Arg＞His）;g.4953C＞T位于外显子8,为同义突变。经检测,在一个30头的北京黑猪群体中,除g.1147C＞G位点外,另外2个位点均处于哈代－温伯格平衡状态。     

中国美利奴羊TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在研究Toll样受体2（Toll-like receptor,TLR2）基因的多态性及其与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性的相关性。利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊TLR2基因序列进行比对,选出多态位点丰富的片段进行扩增,运用PCR-SSCP的方法对206个中国美利奴布鲁氏菌病阴性样本和80个中国美利奴羊布鲁氏菌病阳性样本进行TLR2基因的多态性检测,然后对不同等位基因的PCR产物进行测序,确定该基因的多态性位点,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学软件分析RNA二级结构及蛋白质的二级结构。结果表明,在279 bp的序列中共检测到3个SNPs,分别为：C1731T、G1737C和G1749T,均未引起对应氨基酸的改变,属于无义突变。这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及基因型频率均不存在显著差异（P>0.05）。各突变位点均能引起RNA二级结构和最小自由能的改变,而蛋白质的二级结构均未改变。由此得出,中国美利奴羊TLR2基因的3个SNPs位点（C1731T、G1737C和G1749T）与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

阿勒泰羊Myf 5基因多态性与早期生长发育性状的相关性分析

采用PCR测序方法研究了152只阿勒泰羊群体Myf5基因多态性及其与群体生长发育性状的相关性。结果表明：在阿勒泰羊Myf5基因中存在3个多态位点，即位于Myf5基因第1外显子区域的19-CCT Ins/Del、第4外显子区域的C-109G以及C-383T；在这些位点均存在3种基因型。多态位点与体重和日增重的相关性分析表明，仅SNP位点C-383T与体重和平均日增重具有相关性（P〈0.05），不同基因型体重和日增重排序为TT〈CT〈CC。说明Myf5基因该位点可能是影响阿勒泰羊生长发育性状的主效QTL或与之紧密连锁，可作为阿勒泰羊肥羔生产的候选分子标记。     

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR 技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy 质粒中,重组质粒用PCR 扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比,同源性分别为77.68%～97.28%和71.82%～98.18%,显示了很强的保守性;小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异,氨基酸序列23～36存在高变异区。     

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊（无角型）、东北细毛羊、杜×寒杂交羊（F1）、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）、生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度（He）、纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60 bp 3个碱基（CTT）缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊（F3）、白头杜泊羊的χ²值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著（P>0.05）;GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型：DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型：DD,该突变为GDF9基因外显子2上477 bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ²值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。     

绵羊BMP15基因外显子单核苷酸多态性研究

以控制Belclare和 Cambridge绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15( Bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测BMP15基因在中国部分绵羊品种 (蒙古羊、内蒙古细毛羊、呼伦贝尔羊、中国美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究突变位点对绵羊繁殖力的影响.结果表明:在4个绵羊品种中均检测到BMP15的突变,检测到的BMP15突变在4个绵羊品种中均呈现3种基因型.这表明BMP15基因外显子Ⅰ中虽然存在突变位点,但这一突变位点对绵羊繁殖力高低没有显著影响.     

哈萨克羊iNOS基因多态性与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在探讨哈萨克羊诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因多态性与布鲁氏菌病的相关性。使用虎红平板凝集试验（RBPT）方法对231只哈萨克羊血清进行布鲁氏菌病血清学检测,参考GenBank中绵羊iNOS基因序列,针对其第6、7、8外显子及其邻近内含子片段设计引物,利用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对231只哈萨克羊的iNOS基因进行多态性检测,分析其SNPs与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。结果表明,67只哈萨克羊为布鲁氏菌感染阳性,阳性检出率为29.00%。在哈萨克羊iNOS基因的外显子6和8片段上未检测到多态位点,在外显子7片段上检测出F7-T18054C和F7-C18084T 2个多态位点,在F7-T18054C多态位点上检测到3种基因型（TC、TT、CC）,优势等位基因和基因型分别是C型和CT型,其等位基因频率和基因型频率分别是0.660和0.446。在F7-C18084T多态位点上检测到2种基因型（CT、CC）,优势等位基因频率和基因型分别是C和CC型,其等位基因和基因型频率分别是0.946和0.892。F7-C18084T属于低度多态（PIC<0.25）,F7-T18054C属于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。相关性分析表明,F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性无显著相关性（P>0.05）。试验结果表明,哈萨克羊iNOS基因F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性不存在相关性。