特异性靶向犬细小病毒融合DNA疫苗的构建及免疫效果的研究

研究旨在构建特异性靶向犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）融合DNA疫苗,探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。试验用重组技术构建了含细胞毒性T淋巴细胞抗原-4胞外区（CTLA-4₁₂₅）与犬细小病毒VP2的主要抗原表位区域（VP2₂₂₈）融合表达质粒pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈,同时构建了不含CTLA-4₁₂₅的pVAX1-VP2₂₂₈,体外转染COS-7细胞,Western blotting检测其表达产物;将pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈、pVAX1-VP2₂₂₈分别免疫小鼠,免疫后进行抗体水平测定和抗体亚型分析;通过淋巴细胞增殖试验和ELISA分别检测淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平。结果显示成功构建了pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈和pVAX1-VP2₂₂₈,并能在COS-7细胞中正确表达;抗体检测结果显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组抗体水平显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.05）;淋巴细胞增殖试验显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组的刺激指数显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.05）;γ-干扰素表达水平测定显示pVAX1-CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈免疫组极显著高于pVAX1-VP2₂₂₈免疫组（P<0.01）。结果表明,CTLA-4₁₂₅-VP2₂₂₈融合DNA能有效增强动物对VP2₂₂₈抗原的免疫应答,为进一步研究融合DNA疫苗特异性的靶向递呈机制奠定基础。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒主要抗原蛋白。研究证实由VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为提高VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究在小鼠体内尝试了利用犬白细胞介素2（cIL-2）基因增强VP2DNA疫苗免疫应答的研究。通过RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中分别扩增含终止密码子和不合终止密码子的cIL-2cDNA基因,然后将基因插入到真核表达载体pcDNA3．1中,分别构建成非融合的和与Myc／His融合的clL-2基因真核分泌型表达载体,pcDNA-cIL-2和pcDNA-cIL-2／MH。将pcDNA-oIL-2／MH表达栽体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达栽体能否介导cIL-2在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2表达载体（pcDNA-CD5sp-VP2,本室构建）单注射和VP2／IL-2表达载体共注射对小鼠进行免疫（用pcD-NA3．1栽体作为阴性对照）。免疫后通过ELISA方法检测免疫后不同时期小鼠血清VP2的抗体水平,并通过细胞增殖试验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。试验结果表明,扩增的小鼠cIL-2基因与GenBank的参考序列一致,构建的cIL-2表达载体能够介导重组cIL-2在HEK293T细胞中进行分泌表达。免疫结果显示,利用cIL-2／VP2表达载体共免疫小鼠,免疫后35d血清中VP2的抗体水平达到1：5120,明显高于VP2表达载体单免疫组（P〈0．01）。淋巴细胞增殖试验表明,2组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于阴性对照组（P〈0．01）,共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组（P〈0．05）。共免疫小鼠淋巴细胞7干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组（P〈0．01）。由此可见,cIL-2表达载体可明显提高CPVVP2基因疫苗的免疫应答水平。     

前列腺素E2受体激动剂和雌激素对奶牛输卵管上皮细胞中转化生长因子β3表达的影响

本试验旨在观察前列腺素E₂受体激动剂(布他前列腺素(butaprost))与雌激素对奶牛输卵管上皮细胞中转化生长因子β₃(TGFβ₃)表达的影响,阐明butaprost和雌激素对奶牛输卵管上皮细胞TGFβ₃有无协同调控作用.采用胰酶消化法及机械法分离培养奶牛输卵管上皮细胞,分别将butaprost和雌激素作用于体外培养的奶牛输卵管上皮细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测butaprost和雌激素对奶牛输卵管上皮细胞中TGFβ₃ mRNA表达的影响.结果显示,与0 h作用组相比,雌激素作用16、24和48 h时对奶牛输卵管上皮细胞TGFβ₃的表达量均极显著升高(P< 0.01),4 h的表达量极显著降低(P< 0.01);且受体激动剂butaprost和雌激素有协同调控TGFβ₃的效应;加入吲哚美辛后能有效抑制内源性前列腺素对TGFβ₃表达的作用.结果表明,butaprost和雌激素可调控奶牛输卵管上皮细胞TGFβ₃ mRNA 的表达.     

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）结构蛋白VP1上的RGD（Arg-Gly-Asp）基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术（SPR）的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β₆亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M^-1s^-1、3.1×10^-4s^-1和7.33×10^-6M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M^-1s^-1、2.13×10^-4s^-1和9.79×10^-5M;与β₆亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ₆胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。     

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β₂肾上腺素能受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β₂AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-β₂AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N、myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-C285S和myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β₂AR基因已正确重组入pcDNA3.1（+）载体中;经测序鉴定,猪β₂AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β₂AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β₂AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

Expression and Protective Efficacy of Clostridium perfringens β toxin Derivative

This study was conducted to obtain the Clostridium perfringens β toxin (CPB) derivative and to evaluate its virulence and immunoprotection. Based on the known sequence, four amino acid mutations, R212E, L268G, Y266A and W275A, were introduced into the gene of Clostridium perfringens CPB. Meanwhile, genes of Th cell and N-terminal of flagellin were added to 5' of the CPB gene, respectively. Then the gene GTF_NCPB_m4 was optimized and synthesized, and was subsequently cloned into the prokaryotic expression vector pET-30a (＋) for expression and purification to get the recombinant protein, rTF_NCPB_m4. Reactivity of rTF_NCPB_m4with antiserum of Clostridium perfringens type C crude toxins was detected by Western blot. Meanwhile, the toxicity of rTF_NCPB_m4 to mice was evaluated. According to the method prescribed in Chinese Veterinary Pharmacopoeia (2015), rabbits were immunized with rTF_NCPB_m4 to prepare antiserum and detect the neutralizing titer against Clostridium perfringens type C crude toxins. Results showed that rTF_NCPB_m4 was presented predominantly in an insoluble form (inclusion bodies), and it could react with the antiserum of Clostridium perfringens type C crude toxins. rTF_NCPB_m4 with an injection volume of 50 μg was still not fatal to mice. Sera from rabbits immunized with rTF_NCPB_m4can neutralize 10-20 mouse minimum lethal doses (MLD) of Clostridium perfringens type C crude toxins after twice immunization. Moreover, rabbits immunized with rTF_NCPB_m4 can fully resist 1 rabbit MLD of Clostridium perfringens type C crude toxins challenge, whereas all of the rabbits died (4/4) in the control groups. These data suggest that rTF_NCPB_m4 is a potential vaccine candidate for the subunit vaccine of Clostridium perfringens type C.     

Effect of ovarian regression and molt on plasma concentrations of thymosin beta 4 in domestic hens (Gallus domesticus).

Molt induced by infusion of a gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRH-A, ([D-leu⁶, Pro⁹]-GnRH N-ethylamide]) or feed withdrawal (FW) has been used as a model to study interactions between ovarian activity and thymosin β₄ during molting in domestic hens. Thirty-three laying hens were divided into three groups: 1, controls, 2, GnRH-A infusion induced molt (GnRH-A), or 3, FW induced molt. All groups had reduced daylength. Blood was sampled weekly and assayed for concentrations of thymosin β₄ and progesterone (P₄). Plasma P₄ concentrations were significantly depressed in both treatment groups compared to controls, indicating ovarian regression. Plasma P₄ concentrations had returned to control values in the GnRH-A group by 28 d after the start of treatment, while P₄ was still depressed in the FW group at day 42 when the experiment ended. Plasma concentrations of thymosinβ₄ were elevated relative to controls from day 7 through day 14 in the GnRH-A group and from day 7 until day 28 in the FW group. It is concluded that plasma concentrations of thymosin β₄ are elevated during molting in domestic hens, but the elevation is not attributable to depressed P₄ concentrations.     

Purification and partial characterization of thyroid hormone binding proteins in canine serum

Thyroxine-binding prealbumin (TBPA) and thyroxine-binding globulin (TBG) were isolated from canine serum and partially characterized. TBPA was isolated by retinol-binding protein (RBP) affinity chromatography and further purified by preparative agarose gel electrophoresis or FPLC ion exchange chromatography. TBG was purified by thyroxine (T₄)-Sepharose chromatography followed by gel filtration on Sephacryl S-300 and preparative electrofocusing in a granulated dextran gel. Molecular weights were estimated by SDS-polyacrylamide gradient gel electrophoresis. Canine TBPA had a tetramer molecular weight of 56,000, an extinction coefficient of 12.8 cm²cg⁻¹, an isoelectric point of 5.26–5.70 and a microheterogeneity pattern similar to that of human TBPA. Partial immunochemical identity with human TBPA was also found. Plasma concentrations of TBPA were measured by rocket immunoelectrophoresis in 43 normal and 35 hypothyroid dogs. Reference levels for TBPA ranged between 205 and 474 mg/l. Hypothyroid dogs had a mean TBPA level of 315.0 mg/l (SD: 91.1 mg/l). TBG had a molecular weight of 75,000 and an isoelectric point of 5.0. No immunochemical identity with human TBG was found. Gel filtration of serum on Sephacryl S-200, identification of T₄-binding proteins with ¹²⁵I-T₄, and protein- and lipoprotein staining of fractions was performed. Thyroxine-binding was found to TBG in the β-globulin region, TBPA in the ₂-region, albumin, and to the high density lipoprotein (HDL₂) in the ₁-region and the very low density lipoprotein (VLDL) in the pre-β region. A corresponding band to the latter protein in serum was masked by TBG and TBPA, and T₄-binding in the ₁-region was not always seen in serum. Many similarities were found between man and dog regarding TBPA, but not TBG. The differences in structure of TBG may in part be responsible for the low serum T₄ levels and rapid T₄ metabolism seen in dogs.     

DNA Immunization Against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus with VP2‐4‐3 Gene and Chicken IL‐6 Gene

The present study was to investigate the feasibility and efficiency of the DNA vaccine to protect chickens against very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) infection. A plasmid DNA carrying VP2‐4‐3 genes of vvIBDV SH95 and a plasmid DNA carrying chicken interleukin‐6 (ChIL‐6) genes were constructed and designated as pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 and pALTER‐MAX‐ChIL‐6 respectively. Several DNA vaccination experiments were performed: 1‐week‐old chickens were intramuscularly injected with only plasmid pcDNA3‐VP2, pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 or mixture with pALTER‐MAX‐ChIL‐6. The chickens at 4 weeks old were orally inoculated with vvIBDV SH95. The results showed that immunization with the mixture of pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3 and pALTER‐MAX‐ChIL‐6 three times conferred protection for 90% of chickens. Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) antibody titres in chickens immunized together with pALTER‐MAX‐ChIL‐6 were higher than those immunized simply with plasmid pcDNA3‐VP2 or pALTER‐MAX‐VP2‐4‐3. IBDV was not detected in the bursa of the protected chickens at 8 days after challenge by RT‐PCR. The results indicate that protection against vvIBDV can be achieved by using the VP2‐4‐3 gene of vvIBDV as a DNA vaccine. Furthermore, the simultaneous injection of ChIL‐6 plasmid significantly increased the protection after challenge with the very virulent strain.     

苜蓿、玉米青贮饲料有氧稳定性研究

为评价苜蓿(Medicago sativa)和玉米(Zea mays)青贮饲料的有氧稳定性,采用CO₂滴定法和微生物培养法,分别对有氧暴露0、2、4、6、8、10 d的苜蓿、玉米青贮饲料,以及有氧暴露0、2、4 d的苜蓿青贮饲料和玉米青贮饲料的全混合日粮有氧稳定性进行分析与测定。结果表明:苜蓿青贮饲料在有氧暴露10 d时pH升高0.38,玉米青贮饲料则升高0.60;有氧暴露4d时,苜蓿青贮饲料CO₂产量低于1 g/kg·DM,而玉米青贮饲料则高达5.4 g/kg·DM;苜蓿青贮饲料的酵母菌和霉菌数量从1.58×10₂CFU/g·DM和2.51×10₂CFU/g·DM显著增加到2.51×10₃CFU/g·DM和7.94×10₂CFU/g·DM(P<0.05),而玉米青贮饲料在有氧暴露2 d时即从2.51×10₂CFU/g·DM和1.26×10₂CFU/g·DM显著提高到3.98×10₃CFU/g·DM和3.16×10₃CFU/g·DM(P<0.05);这说明苜蓿青贮饲料的有氧稳定性要优于玉米青贮饲料;在有氧暴露的4d内,虽然苜蓿青贮饲料全混合日粮的pH变化为0.93,低于玉米青贮饲料2.18,但酵母菌和霉菌的数量无明显差异,在有氧暴露2 d后均显著地增加(P<0.05)。     

真姬菇菌糠碱贮效果研究

为了研究真姬菇菌糠碱贮效果,试验采用CaO、Ca（OH）₂、CaO+3%尿素及Ca（OH）₂+3%尿素4种碱贮处理,每种处理碱（CaO或Ca（OH）₂）的添加量设3%、4%、5%及6% 4个水平,分别为CO3、CO4、CO5、CO6,CH3、CH4、CH5、CH6,COU3、COU4、COU5、COU6,CHU3、CHU4、CHU5、CHU6,每个水平4个重复,2个空白组,1组空白（CK）仅为真姬菇菌糠,另1组空白（CKU）为真姬菇菌糠+3%尿素,室温下碱贮30 d。结果表明：CO3、CO4、CO5、CO6组酸性洗涤纤维（ADF）和游离棉酚含量较CK组分别降低8.61%、12.69%、13.74%、16.63%和29.58%、33.92%、39.04%、41.31%,CO5、CO6组中性洗涤纤维（NDF）、酸洗木质素（ADL）含量较CK组显著降低（P<0.05）,可降解细胞壁（CB₂）和相对饲喂价值（RFV）较CK组显著提高（P<0.05）;CH3、CH4、CH5、CH6组ADF和游离棉酚含量较CK组分别降低7.30%、10.90%、13.90%、17.14%和28.47%、32.69%、40.48%、43.59%,CH5、CH6组NDF、ADL含量较CK组显著降低（P<0.05）,CB₂和RFV较CK组显著提高（P<0.05）;COU3、COU4、COU5、COU6组NDF、ADF和游离棉酚含量较CKU组分别降低6.72%、8.86%、9.78%、12.10%;14.63%、16.37%、18.19%、20.21%及5.49%、14.24%、23.63%、24.66%,RFV提高18.97%、23.19%、25.86%、30.79%;CHU3、CHU4、CHU5、CHU6组NDF、ADF、ADL和游离棉酚含量较CKU组分别降低8.34%、11.87%、14.08%、16.97%,11.94%、15.19%、18.21%、19.06%,7.40%、14.93%、19.47%、19.30%和6.84%、15.60%、22.39%、24.10%,RFV提高18.88%、26.20%、34.00%、37.88%。CaO与Ca（OH）₂碱贮效果相近,添加3%尿素碱贮较CaO或Ca（OH）₂直接碱贮效果更佳,且可长期保存。     

非洲猪瘟病毒P72蛋白合成肽疫苗的构建及其免疫效力评估

【目的】构建非洲猪瘟病毒CAS19-01/2019株(GenBank登录号:MN172368.1)结构蛋白P72的合成肽疫苗,通过免疫小鼠评估合成肽疫苗的免疫效力。【方法】利用ProtParam、SOPMA等软件分析P72蛋白的理化性质与结构信息,通过ABCpred、SVMtrip、IEDB预测P72蛋白的T细胞与B细胞抗原表位,筛选出显著的表位多肽区域,合成多肽辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫小鼠,检测免疫组小鼠产生的特异性抗体、T淋巴细胞亚群、脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子白介素4(IL-4)、IL-2、γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白(IgG),从体液免疫与细胞免疫角度评估合成肽的免疫效力。【结果】综合分析得出P72蛋白是稳定性亲水蛋白,二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲分别占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。筛选出了P72蛋白的8个优势抗原表位,626－634、520－528、298－306、203－211位氨基酸处为T细胞抗原表位,587－606、232－251、110－129、39－58位氨基酸处为B细胞抗原表位。整合优势表位合成2个多肽P72-1与P72-2,首次免疫小鼠14 d时可检测到P72-1与P72-2的特异性抗体,首免后28 d达到最高值,其最高抗体效价分别为1∶25 600与1∶12 800;免疫后小鼠T淋巴细胞亚群CD4^＋/CD8^＋显著上升(P＜0.05);脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫组淋巴细胞数量均极显著升高(P＜0.01);细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ含量均极显著增加(P＜0.01)。【结论】本研究成功研制2种合成肽疫苗,在免疫效力上P72-2高于P72-1,二者都能产生高水平的特异性抗体,刺激脾脏淋巴细胞增殖,诱导产生细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ,本研究为非洲猪瘟合成肽疫苗研制奠定技术基础。     

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础.     

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因工程疫苗，以伪狂犬病毒（PRV）gE基因缺失标志疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为病毒载体，通过同源重组，构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22（BHV-1 VP22）融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确，并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB／c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应，并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-／gE^-／E^＋与TK^-／gE^-／E^＋／M^＋进行比较。结果显示TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应，BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。     

猪IL-2对pcDNA—E39．VP2真核共表达质粒免疫原性的影响

为了研究猪IL-2基因的真核质粒和融合基因形式对pcDNA—E39．VP2真核共表达质粒的免疫增强作用,分别将IL-2基因插入pcDNA3．1（＋）和pcDNA—E39．VP2（已构建）中构建重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-E39．VP2。将真核质粒pcDNA-IL2-E39．VP2免疫小鼠,另外,将pcDNA—IL2分别先于和后于pcDNA-E39．VP23d免疫小鼠,同时设pcDNA-E39．VP2对照组。对免疫小鼠进行PPV（JEV）抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖功能和外周血T淋巴细胞亚群变化的检测。结果显示,1周后,pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组和pcDNA—IL2后于pcDNA—E39．VP注射的免疫组JEV／PPV抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖活性显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01）高于对照组,pcDNA-IL2先于pcDNA—E39．VP注射的免疫组仅在第5周显著（P〈0．05）高于对照组;各组（除对照组外）CD8^＋值差异不显著（P〉0．05）,CD4^＋、CD4／cD8值都高于对照组,其中pcDNA-IL2-E39．VP2免疫组与对照组差异极显著（P〈0．01）。结果表明,IL-2能增强pcDNA-E39．VP诱导小鼠的免疫能力,且以融合基因形式构建的真核质粒免疫增强效果最明显。     

前列腺素E2和F2α对LPS刺激后奶牛子宫内膜上皮细胞COX-1和COX-2表达的影响

试验旨在阐明前列腺素E₂（prostaglandin E₂,PGE₂）和F_2α（prostaglandin F_2α,PGF_2α）对体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞中环氧合酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1））与环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达的影响。培养奶牛子宫内膜上皮原代细胞和传代细胞,第4代细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板,以10^-7mol/L PGE₂和PGF_2α分别预处理细胞24 h,以100 ng/mL细菌脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激细胞4、8和12 h后分别提取RNA和总蛋白质,采用实时荧光定量PCR与Western blotting等技术检测COX-1与COX-2 mRNA和蛋白质的表达量。结果表明,与对照组相比,COX-1 mRNA表达量在PGE₂单独作用4、8和12 h后显著上调（P<0.05）;COX-2 mRNA表达量在PGE₂单独作用4和12 h后显著上调（P<0.05）,PGE₂单独处理使COX-1、COX-2蛋白表达量均显著上调（P<0.05）。与对照组相比,LPS刺激8和12 h时COX-1 mRNA表达量显著下调（P<0.05）,LPS刺激后COX-1蛋白表达量无显著变化（P>0.05）;LPS刺激后4、8和12 h时COX-2 mRNA表达量显著上调（P<0.05）,LPS刺激后COX-2蛋白表达量显著上调（P<0.05）。与LPS单独处理组相比,LPS+PGE₂处理组在8和12 h时COX-1和COX-2 mRNA表达量均显著上调（P<0.05）,同时COX-1和COX-2蛋白表达量也显著上调（P<0.05）。PGF_2α在LPS未刺激和刺激后对COX-1和COX-2 mRNA的表达无显著影响（P>0.05）,仅在PGF_2α单独处理8和12 h后COX-1 mRNA表达量上调（P<0.05）。两种激素联合处理与各自单独处理及LPS单独刺激相比,对COX-1和COX-2 mRNA表达具有一定的协同诱导作用。