猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929 bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5 ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%～98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州PT分离株Nsp2基因克隆及序列变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株 Nsp10基因生物信息学分析

本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建立奠定基础。应用BioEdit、DNAStar、PsortⅡ、SignalP、TMHMM、ProtFun、Clustal_1.81、Mega等软件对Nsp10蛋白的理化参数、信号肽、跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、二级结构、亚细胞定位及与其他PRRSV毒株相应片段同源性等进行分析和预测。该蛋白理论分子质量为26.38 ku,pI为8.93,为稳定蛋白,不含信号肽,无跨膜结构,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明,该蛋白极有可能位于细胞质,其编码氨基酸序列与参考毒株同源性为97.4%~100%。该蛋白保守性较高,是可溶性蛋白,有良好的抗原性,具备作为靶蛋白建立免疫方法的条件。     

五株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及序列分析

为研究猪流行性腹泻病毒的流行情况并分析该病毒的培养特性,对甘肃、北京、河北、山西、浙江五个猪场送检的疑似猪流行性腹泻病猪小肠内容物,用RT-PCR方法进行检测,证明为猪流行性腹泻病毒核酸阳性。然后将阳性病料进行传代培养、病毒含量测定以及特异性检验,证明获得五株猪流行性腹泻病毒,分别命名为Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08。对分离的毒株进行S基因全长测序及氨基酸序列分析。结果表明:五株分离毒株在盲传19代开始出现明显的细胞病变,盲传到24代,出现稳定的细胞病变且五株分离毒株的24代病毒含量在104.5~5.0TCID50/m L之间;用S蛋白进行进化树分析表明,五株分离毒株与近年来国内流行毒株亲缘关系很近,在同一个进化分支上;分离的五株野毒株之间的氨基酸同源性高达99.2%~99.9%,而这五株野毒与Gen Bank上提交的2011年、2012年分离的野毒株的之间的氨基酸同源性为98.4%~99.9%;实验室分离毒株及国内近年流行毒株均与国内外经典毒株存在一定的共性,即特定位置氨基酸的插入、缺失或置换。     

1株基因重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的新型变异和遗传进化分析

对山东省某地区初诊为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduction and respiatory syndrome,PRRS)的猪病料采用RT-PCR进行鉴定,获得1株PRRSV并命名为SD18.对该分离株的第2代细胞培养毒株进行全基因组测序,与其他参考毒株比较同源性并构建遗传进化树.结果显示,SD18毒...     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测

将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNAStar软件进行序列分析。结果表明,SC-JX01株Nsp2基因与GenBank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性为98.1%~99.1%,氨基酸的相似性为95.9%~98.0%,具有相同的30个氨基酸缺失。本研究表明,SC-JX01株Nsp2基因与分离自不同地区高热病毒株的Nsp2基因序列具有相同的缺失。由于SC-JX01株的Nsp2基因存在氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定

对河南漯河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理,接种到原代猪肺泡巨噬细胞中,经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株,命名为HeNLH2017株,并测定了该分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点,扩增测定了ORF5基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示,该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30毒株同源性最高,分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示,该分离株与我国2013年以来流行的NADC30-like(Lineage1)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点,且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成功分离到1株NADC30-like毒株,有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病特点。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的ORF5和Nsp2（2503～3269nt）基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）的序列同源性最高,为96．8％～98．2％,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸（R）,137位为丝氨酸（S）,表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）毒株的序列同源性最高,为96．5％～98．0％。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

华中地区猪繁殖与呼吸综合征病毒临床流行毒株Nsp2和GP5氨基酸的遗传变异分析

为了解当前猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2013-2014年间来源于中国华中地区湖北、河南和湖南3省20个猪场65份疑似PRRSV感染的临床样品开展病毒分离工作,通过RT-PCR及间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示成功分离到4株PRRSV。通过测序获得它们的部分Nsp2氨基酸序列,经比对分析,确定分离毒株皆为变异毒株,并且与JXA1、TJ等高致病性毒株有相同的遗传特点,在Nsp2区域有30个氨基酸的不连续缺失。本研究将从临床样品中测序获得的23株PRRSV的GP5氨基酸序列与GenBank公布的有代表性的毒株序列进行遗传进化分析,结果显示所有毒株均为美洲型毒株,其中21株与高致病性变异毒株(JXA1、TJ和HUN4)同源性较高,同时在主要中和位点和N-糖基化位点存在部分氨基酸突变,另外两株与疫苗毒株RespPRRS MLV同源性较高。本试验结果表明,当前高致病性PRRSV依然是优势毒株,其GP5氨基酸突变频繁,不同地区流行毒株存在一定的遗传差异。     

两株高致病性PRRSV湖北分离株ORF5与Nsp2基因序列分析

2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析

为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%~97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GD-ZQ变异株的分离及遗传变异分析

用RT-PCR方法从某猪场病猪体内分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),命名为PRRSV GD-ZQ株,可致Marc-145细胞病变。细胞分离培育病毒至增殖性能稳定后,分别扩增分离病毒的Nsp2、ORF3、ORF5基因并测序,绘制进化树比较分析遗传进化。结果显示分离毒株的Nsp2、ORF3、ORF5基因序列与美洲型VR-2332、CH-1a等毒株核苷酸序列相似性在89.0%~95.8%之间,与欧洲毒株LV的相似性在48.2%~49.3%之间,遗传进化分析显示该毒株与CH-1a株处于同一分支,分离毒株的Nsp2序列与以HEB1为代表的PRRSV变异株相似性在98.3%~99.4%之间。该病毒在细胞盲传5代能产生稳定规律细胞病变(CPE),且第5代病毒TCID₅₀达10^-5.6／0.1 mL。进化分析结果显示GD-ZQ分离株是PRRSV变异株,具有"高热病"PRRSV毒株的变异特点,为了解PRRSV在时间上和分子水平上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围奠定基础。     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株FS的分离鉴定与全基因组序列分析

从一例疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病例中分离到一株病毒,经全基因组测序分析可知此毒株在Nsp2部位发生了30个氨基酸的缺失,GP5蛋白相对保守。本毒株与VR-2332同源性达到88.7%,与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源性为58.5％,与国内报道的JN-HS毒株相似性最大,核苷酸同源性达到98.8%。     

IBV安徽分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

利用设计的1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增出4株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)安徽地方分离株膜蛋白M基因全长片段并进行了克隆测序。将各IBV安徽地方分离株与GenBank中注册的一些毒株M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较和系统进化关系分析,发现毒株间核苷酸序列同源性为88.5%~100%,其相应的氨基酸序列同源性为90.3%~100%;不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异,从ATG至第140 bp区段的核苷酸序列变异频率最高;4株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群,与我国常用疫苗毒株H120、M41和W 93不属同一个进化亚群。     

Neorickettsia risticii surface-exposed proteins: proteomics identification, recognition by naturally-infected horses, and strain variations

ABSTRACT: Neorickettsia risticii is the Gram-negative, obligate, and intracellular bacterial pathogen responsible for Potomac horse fever (PHF): an important acute systemic disease of horses. N. risticii surface proteins, critical for immune recognition, have not been thoroughly characterized. In this paper, we identified the 51-kDa antigen (P51) as a major surface-exposed outer membrane protein of older and contemporary strains of N. risticii through mass spectrometry of streptavidin-purified biotinylated surface-labeled proteins. Western blot analysis of sera from naturally-infected horses demonstrated universal and strong recognition of recombinant P51 over other Neorickettsia recombinant proteins. Comparisons of amino acid sequences for predicted secondary structures of P51, as well as Neorickettsia surface proteins 2 (Nsp2) and 3 (Nsp3) among N. risticii strains from horses with PHF during a 26-year period throughout the United States revealed that the majority of variations among strains were concentrated in regions predicted to be external loops of their β-barrel structures. Large insertions or deletions occurred within a tandem-repeat region in Ssa3. These data demonstrate patterns of geographical association for P51 and temporal associations for Nsp2, Nsp3, and Ssa3, indicating evolutionary trends for these Neorickettsia surface antigen genes. This study showed N. risticii surface protein population dynamics, providing groundwork for designing immunodiagnostic targets for PHF.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2 基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基〖JP2〗因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株S1基因遗传变异分析

We designed and synthesized two pairs of specific primers amplified S1 gene by RT-PCR method to investigate the variation in S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in 2012 in Henan.S1 genes of 5 PEDV strains were cloned and sequenced, and their phylogenetic trees were analyzed from different swine breeding farms. Sequences analysis showed that S1 genes shared 98.3% to 99.5% nucleotide identities and 97.1% to 98.9% amino acids homologies among five PEDV isolates. Compared with domestic landing PEDV from 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 98.0% and amino acid homologies were 85.3% to 98.7%. Compared with CV777, the nucleotide homologies were 88.7% to 89.1% and amino acid homologies were 87.3% to 88.4%. Homology analysis showed that S1 genes of 5 isolates shared the same genetic mutation, there were the same insertions and deletions. Compared with domestic mutant strains landed from 2011, there was no tendency. However, compared with CV777, there were three nucleotide insertions from 163 to 166 bp, nine nucleotide insertions from 173 to 174 bp, three nucleotide insertions from 405 to 406 bp and three nucleotide deletions from 463 to 464 bp. These insertions and deletions of nucleotides led to its corresponding changes in encoding amino acids. Phylogenetic analysis showed that S1 genes of 5 PEDV strains belonged to the third group. However compared with part of PEDV first group domestic mutant strains landed in 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 89.3% and amino acid homologies were 85.3% to 86.9%. CV777 was the second group. The results showed that S1 genes of PEDV prevalent strain exist in first and third groups, but mainly prevailing third group strains, the pathogenic and antigenic differences of these strains should be further studied.