蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及功能预测

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)编码4种非结构蛋白(NS1~NS4),其中NS4是新发现的非结构蛋白。为深入探索该新型非结构蛋白的功能,本研究首先采用生物信息学分析其序列结构特征及可能的功能域,结果发现NS4蛋白的N端α-螺旋结构域中具有富含碱性氨基酸的核定位信号(NLS),而C端α-螺旋结构域中具有亮氨酸拉链结构的核输出信号(NES)。为进一步证实NS4的亚细胞定位,本试验构建了表达NS4全长及其缺失突变体的重组质粒,结果显示缺失NLS的NS4重组蛋白弥散在胞浆,而缺失NES后NS4重组蛋白只定位于细胞核,表明NS4蛋白亚细胞定位具有核-胞浆穿梭过程。最后结合3D同源建模发现NS4与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPβ)等具有较高的同源性,据此推测NS4可能为转录调控蛋白,与DNA或其他转录因子存在相互作用。总之,本研究为NS4蛋白的功能研究提供了更多新线索和新思路,填补了BTV基础研究的空白。     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位

【目的】对羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷(cytarabine, Arac)存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色...     

布鲁菌分泌蛋白BspG的亚细胞定位分析

本研究旨在确定布鲁菌分泌蛋白BspG在宿主细胞中的亚细胞定位.通过生物信息学分析预测BspG蛋白序列特征及功能域,构建立体模型;使用常规分子克隆技术以布鲁菌16M株为模板进行目的基因扩增,构建pMD19-T-BspG克隆载体及pDsRed2-C1-BspG重组真核表达载体,真核载体转染HEK293T细胞,RT-PCR检...     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

Expression,Identification and Subcellular Localization of V Protein of Canine Distemper Virus

In order to study the function of canine distemper virus (CDV) V protein,V gene fragment was inserted into the pGEX-6p-1 vector,and then pGEX-6p-1-CDV-V recombinant expression plasmid was obtained.Purified V protein immunized BALB/c mice to prepare the positive serum.Meanwhile,to confirm the distribution of V protein and subcellular localization with confocal laser technology,a eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was built,then transfected into Vero cells.The results showed that V protein was successfully expressed and the positive serum was prepared.The recombinant plasmid pcDNA3.1-CDV-V was expressed in Vero cells and mainly expressed in cytoplasm.The results laid a function for functional studies of CDV V protein.     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。     

Establishment and Preliminary Application of Indirect ELISA Based on Recombinant NS4 Protein for Detection of Bluetongue Virus Antibodies

This study was conducted to establish an indirect ELISA method for the detection serological antibody of bluetongue virus (BTV). The purified BTV recombinant NS4 protein obtained from the prokaryotic express system was used as the coated antigen, and then an indirect ELISA antibody detection method of BTV was developed by optimizing the reaction conditions. SDS-PAGE results showed that the recombinant NS4 protein with a size of about 52 kDa was obtained, which mainly existed in the supernatant. Western blot results showed that the purified recombinant NS4 protein had good antigenicity. The ELISA reaction conditions were optimized by the square matrix test. The optimal coating amount of recombinant NS4 protein antigen was determined to be 3.0 μg per well, and the optimal dilution ratio of serum to be tested was 1:200, and the optimal dilution concentration of HRP-labeled rabbit anti-cow IgG secondary antibody was 1:4 000, and the critical values were 0.29 and 0.35, respectively. The detection sensitivity of the BTV antibody was up to 1:1 600. The intra-assay repeatability and the inter-assay repeatability coefficient of variation were less than 10%. The positive coincidence ratio and negative coincidence ratio were 98% and 100% respectively. The indirect ELISA method established in this study laid a foundation for clinical serum antibody detection and serum epidemiological investigation of BTV.     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系.作者使用Mega6.0软件绘制了 7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根...     

鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的研制及亚细胞定位

以鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)为免疫原,以DTMUV NS1原核表达蛋白为筛选抗原,获得2株针对DTMUV NS1蛋白的单克隆抗体,并进行NS1蛋白的亚细胞定位。首先,采用DTMUV脑内接种方式免疫BALB/c小鼠3～4次,取BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA法筛选NS1蛋白的单克隆抗体,并通过Western blot进行鉴定。其次,DTMUV感染BHK-21细胞24 h,加入获得的NS1蛋白单抗,结合TMUV感染细胞过程中产生的NS1蛋白,加入FITC标记山羊抗小鼠IgG反应,DAPI核染色,通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光的位置,确定NS1蛋白的亚细胞定位。结果显示,间接ELISA法筛选到2株针对NS1蛋白的杂交瘤细胞株,细胞上清和小鼠腹水抗体滴度高,敏感性强。Western blot鉴定2株杂交瘤分泌的单克隆抗体特异性强。激光共聚焦显微镜观察显示,代表NS1蛋白的绿色荧光主要位于BHK21的细胞质中,这与软件预测结果一致。结果表明,TMUV NS1蛋白亚细胞定位的明确,为进一步理解和揭示该蛋白的结构与功能,蛋白质之...     

非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

A型流感病毒NS1蛋白的结构与功能

A型流感病毒片段8编码的NS1蛋白是病毒复制和传播的重要调节蛋白。它含有3个功能区,即RNA结合区,eIF4GI结合区和效应区。NS1蛋白在A型流感病毒感染细胞中高水平表达,它的主要功能是抑制NF-κB(nuclear factor-κB)活化和IFN(inter-feron)-α/β介导的抗病毒作用,抑制Jun N末端激酶(jun N-terminal kinase,JNK)和AP-1(activating posttranslation)转录因子活化;下调病毒感染细胞凋亡;促进病毒基因表达,抑制宿主mRNA加工和转运。NS1蛋白的深入研究,为今后预防和治疗A型流感病毒寻找突破口。     

牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD）的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb²⁺具有较强的抑制作用,而Ca²⁺对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：160000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。     

布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的亚细胞定位及与宿主细胞互作蛋白的筛选

【目的】 分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】 通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10⁷/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的亚细胞定位研究

为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。     

蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP 2、VP 5、VP 7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP73个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

Construction and Identification of Yeast Two-hybrid Bait Plasmids of Capsid Proteins VP2, VP5 and VP7 of Bluetongue Virus

The structure of bluetongue virus(BTV) was consisted of three layers of capsid proteins, VP2 and VP5 proteins consisted the outer capsid of BTV, VP7 protein consisted the middle capsid of BTV, VP3 consisted the inner capsid of BTV.When BTV infected host cells, VP2, VP5 and VP7 proteins of BTV played important roles in the process of infecting host cells.In order to study the molecular mechanism of interaction between BTV and host cells, we cloned VP 2, VP 5 and VP 7 genes into pGBKT7 vector, three recombinant bait plasmids pGBKT7-VP2, pGBKT7-VP5 and pGBKT7-VP7 were successfully constructed, and then the self-activation and toxicity of the bait plasmids were tested.The results showed that three bait plasmids all had no self-activation and toxicity to yeast cells.This research made a steppingstone for the screening of host-cell protein interacting with VP2, VP5 and VP7 proteins using yeast two-hybrid system, and laid a foundation for investigating the interaction between BTV and its host cells.     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件（BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP）分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4⁺ T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8⁺ T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点（pI）为8.31,化学式为C₃₃₄₇H₅₃₄₆N₉₁₆O₁₀₀₉S₂₈,不稳定系数为35.93,平均亲水性（GRAVY）值为-0.267,表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位：12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位：248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。