子宫蓄脓对犬子宫内膜组织中IGF-2及IGF-1R蛋白表达的影响

探讨IGF-2及IGF-1R蛋白质在子宫蓄脓的表达及与子宫蓄脓发病的相关性。采用免疫组织化学PV法与Western blotting检测5例正常子宫内膜(对照组)、19例子宫蓄脓(试验组)子宫内膜组织中IGF-2及IGF-1R的表达情况。结果表明,免疫组化与Western blotting检测结果一致,IGF-2和IGF-1R在蓄脓子宫组中的表达量极显著高于正常子宫(P<0.01)。对子宫蓄脓组中IGF-1R与IGF-2进行相关性分析,免疫组化结果表明IGF-1R与IGF-2之间低度相关(ｒ=0.423),Western blotting结果显示IGF-1R与IGF-2之间高度相关(ｒ=0.927)。结果提示,IGF-2阳性表达上调及IGF-1R的异常高表达,在子宫蓄脓的发生和发展过程中可能具有重要作用。     

犬脂肪来源间充质干细胞对重症急性胰腺炎体外内质网应激模型的抗凋亡作用

【目的】 探究犬脂肪组织来源的间充质干细胞(cAd-MSCs)对重症急性胰腺炎(SAP)体外模型的抗凋亡作用,以期为利用干细胞治疗胰腺炎提供理论指导。【方法】 ①用Ⅰ型胶原酶消化分离cAd-MSCs,用流式细胞术鉴定其干细胞标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达,用成脂、成骨和成软骨分化来鉴定其多向分化潜能;②用Ⅰ型胶原酶从小鼠胰腺组织中分离胰腺腺泡细胞(PACs),用实时荧光定量PCR检测PACs及胰腺组织中胰腺导管特异性基因CK19、β-胰岛细胞特异性细胞基因Insulin-1、α-胰岛细胞特异性基因Glucagon及PAC特异性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B的表达;③以10、20 μg/mL脂多糖(LPS),10、100 mmol/L雨蛙肽(Caerulein)以及10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein处理PACs,不添加药物培养的细胞为对照组,培养24 h后使用CCK-8检测PACs存活率,筛选体外构建内质网应激模型的最佳处理组(即模型组,P);用CCK-8检测对照组(Naive)及模型组(P)细胞0、2、4、8、12和24 h的存活率,Western blotting检测P组细胞内质网应激相关蛋白的相对表达量;④为确定cAd-MSCs对PACs的作用方式,试验分为PAC组(仅PACs,Naive)、P组、间接共培养组(IC)、直接共培养组(构建PAC模型时与cAd-MSCs直接共培养,DC),用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)基因在PACs中的表达水平;⑤在间接共培养系统中,将细胞分为空白对照组(仅PACs,Naive)、对照组(PACs与cAd-MSCs共培养,C)、P组及试验组(药物处理的PACs与cAd-MSCs细胞共培养,T),细胞培养12 h后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting检测各组细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平的变化,并用TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。【结果】 ①分离培养的cAd-MSCs呈现成纤维样细胞形态,高表达干细胞标志物CD29、CD44、CD73及CD90,不表达CD34和CD45,且具备成脂、成骨、成软骨分化能力;②分离的原代PACs呈鹅卵石样,与胰腺组织相比较,AMY2B、CPA1、PTF1α基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),CK19、Glucagon、Insulin-1基因的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。③与对照组相比,10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein组细胞存活率极显著降低(P<0.01),因此选为构建内质网应激模型的最佳处理组。与对照组相比,4 h时P组PACs的细胞存活率显著降低(P<0.05),8、12、24 h均极显著降低(P<0.01);Western blotting检测结果显示,Grp78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达水平自4 h开始均极显著增加(P<0.01)。④与Naive组相比,P组TNF-α基因的表达水平极显著增加(P<0.01);与P组相比,IC和DC组TNF-α基因表达水平均极显著降低(P<0.01),后续用间接共培养系统进行试验。⑤在间接共培养系统中,与P组相比,T组Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相对表达量均极显著降低(P<0.01)。TUNEL检测结果显示,T组阳性细胞数明显减少。【结论】 本试验成功构建SAP体外内质网应激模型,且证明cAd-MSCs对PACs内质网应激具有调控及保护作用。     

获能处理对猪精子质量及泛素对顶体酶抑制剂水平调控的影响

【目的】探究猪精子体外获能前后顶体酶抑制剂(AI)表达量以及AI的泛素化水平的变化,了解AI与泛素-蛋白酶体系统(UPS)间的联系,为深入研究泛素-蛋白酶体途径(UPP)在猪精子获能过程中的作用提供参考。【方法】选择18～24月龄的成年健康长白公猪,使用手握法采集公猪精液,将一部分精子进行获能处理,一部分作为对照(鲜精),使用计算机辅助精子分析系统(CASA)、低渗肿胀法(HOST)、考马斯亮蓝染色、Western blotting和锌离子(Zn²⁺)标记检测获能前后精子的动力学参数、质量参数、酪氨酸磷酸化水平和Zn²⁺含量;Western blotting检测获能前后精子中AI和泛素(Ub)的表达量;免疫荧光法检测AI和Ub在精子中的定位;免疫共沉淀分析AI和Ub的结合情况。【结果】与新鲜精子相比,获能精子动力学参数VSL和BCF极显著升高(P<0.01),获能精子的活力、质膜完整性、顶体膜完整性、活率均极显著降低(P<0.01);获能精子蛋白酪氨酸磷酸化水平极显著升高(P<0.01),Zn²⁺极显著...     

艾纳香油对NF-κB及Nrf2/HO-1信号通路的作用研究

旨在通过研究NF-κB、Nrf2/HO-1通路来揭示艾纳香油（Blumea balsamifera（L.）DC Oil,BBO）发挥抗炎效果的作用机制。本研究利用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,试验分为空白组、LPS模型组、BBO组（低、中、高剂量）、BBO阴性对照组,每组3个重复,采用Hoechst 33342和PI双染检测BBO对细胞凋亡的影响;采用ELISA和分光光度法检测BBO对LPS诱导巨噬细胞后分泌IL-1β、TNF-α、PGE₂、LTB₄、NO含量及iNOS活力的影响;采用RT-PCR检测BBO对TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平的影响;采用Western blotting检测BBO对NF-κB及Nrf2/HO-1信号通路关键蛋白水平的影响。结果显示,BBO在80 μg·mL^-1剂量范围内可以扭转LPS导致的巨噬细胞形态变化及细胞凋亡发生;与LPS模型组相比,BBO 60~80 μg·mL^-1剂量下可以极显著抑制LPS诱导的细胞炎性因子和炎症介质IL-1β、TNF-α、PGE₂、LTB₄、NO的分泌及iNOS活力（P<0.01）,并极显著抑制LPS导致的细胞IL-1β、TNF-α mRNA表达（P<0.01）;同时,BBO 60~80 μg·mL^-1剂量下极显著下调LPS导致的COX-2、5-LOX、p-IKKα、p-P65、p-IκB-α、胞质Nrf2蛋白表达（P<0.01）,极显著促进HO-1、核Nrf2蛋白表达（P<0.01）,并呈现剂量依赖性关系。结果提示,艾纳香油有良好的抑制细胞炎性和抗凋亡效果,其可能通过抑制NF-p-IκBB通路中关键蛋白磷酸化和炎症因子的产生从而促进Nrf2/HO-1通路中主要抗炎基因表达最终发挥抗炎作用。     

富硒乳酸菌对黄曲霉毒素B1诱导鸡小肠上皮细胞凋亡的影响

试验旨在探究富硒乳酸菌对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)对鸡小肠上皮细胞(CSIEC)凋亡的影响。将体外培养的CSIEC细胞分为对照组(C)、AFB₁(300 μmol/L AFB₁)、AFB₁+0.01 Se(300 μmol/L AFB₁+0.01 μmol/L富硒乳酸菌,以Se计)、AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组,待细胞长至60%~70%汇合时,AFB₁+0.01 Se、AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组培养液更换为含对应Se浓度的培养液,对照组和AFB₁组更换为正常培养液,8 h后向含AFB₁组加入300 μmol/L AFB₁,继续培养24 h。用CCK-8法检测细胞存活率,ELISA法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,TUNEL法检测细胞凋亡率,Western blotting检测线粒体通路和内质网通路相关蛋白Bcl-2、Bax、PERK、ATF4、CHOP、GRP78、p53和p21的表达。细胞存活率检测结果表明,与对照组相比,其余各组CSIEC存活率均极显著降低(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组存活率均极显著升高(P<0.01)。LDH活性检测结果表明,与对照组相比,其余各组LDH活性均极显著升高(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组LDH活性均极显著降低(P<0.01)。细胞凋亡率检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组TUNEL阳性细胞数极显著升高(P<0.01),且与加硒各组差异均不显著(P>0.05)。Bcl-2/Bax表达量检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组Bcl-2/Bax极显著降低(P<0.01),AFB₁+0.05 Se组显著升高(P<0.05)。内质网应激通路相关蛋白表达量检测结果表明,与对照组相比,AFB₁组PERK、CHOP、GRP78和p53的表达量均极显著升高(P<0.01);与AFB₁组相比,加硒各组PERK、GRP78表达量均极显著降低(P<0.01),AFB₁+0.05 Se和AFB₁+0.1 Se组CHOP和p53的表达量均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05)。因此,富硒乳酸菌能够缓解AFB₁诱导的CSIEC凋亡。     

微囊藻毒素-LR对猪体外成熟卵母细胞氧化损伤与凋亡的影响

旨在探讨微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)对体外成熟猪卵母细胞的毒性损伤及其潜在损伤机制.本研究从屠宰场所获得的猪卵巢中收集GV期卵母细胞,将其随机分为4组,在卵母细胞体外成熟培养液中分别添加0、20、40和60μg? mL-1 MC-LR,研究MC-LR对卵母细胞第一极体(Pbl)排出、纺锤...     

沙门菌通过NF-κB/β-catenin信号通路引致IPEC-J2损伤的分子机制

为研究沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制,试验用沙门菌刺激IPEC-J2,在特定时间收集细胞及其培养上清液,采用荧光定量PCR或ELISA检测细胞紧密连接蛋白、炎症反应相关蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达以及乳酸脱氢酶（LDH）含量,以确定该沙门菌能够引起IPEC-J2损伤,并进一步采用NF-κB抑制剂和小干扰RNA预处理IPEC-J2,分析了NF-κB/β-catenin信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的调控作用。结果显示,与对照组相比,沙门菌感染组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA表达量在感染后6和24 h呈极显著下降（P<0.01）;促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的生成量以及LDH释放量在感染后6、12和24 h呈极显著上升（P<0.01）,NF-κB p65的mRNA表达在感染后1、3和6 h也呈极显著上升（P<0.01）;细胞增殖蛋白cyclin D1和c-Myc的mRNA表达在感染后6、12和24 h呈显著下降（P<0.05）,其转录调控因子β-catenin的mRNA表达在感染后24 h呈极显著下降（P<0.01）。与沙门菌感染组相比,抑制剂+沙门菌感染组ZO-1和Occludin的mRNA表达量在12和18 h呈极显著增高（P<0.01）,而NF-κB p65、TNF-α和IL-8的表达以及LDH释放量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）;siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）,LDH释放量在6和12 h均呈极显著增加（P<0.01）,但在18 h增加不显著（P>0.05）。本试验结果表明,沙门菌激活了NF-κB信号通路,促进了促炎性细胞因子的生成,加重了细胞损伤;同时,沙门菌抑制了β-catenin信号通路,降低了细胞增殖蛋白和紧密连接蛋白的表达,影响了细胞修复,从而出现细胞损伤与细胞修复之间的失调,最终呈现出细胞损伤。本试验从NF-κB/β-catenin信号通路的角度揭示了沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制。     

整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛（3~6岁）的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western-blotting,WB）检测整合素αv基因和蛋白的表达情况,运用免疫组织化学法检测整合素αv的定位。结果表明：1）qRT-PCR结果显示,在卵泡期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv基因在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）。2）Western-blotting结果显示,在卵泡期,整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv蛋白在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著,但二者极显著高于壶腹部（P<0.01）。3）免疫组织化学结果显示,整合素αv主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。结果显示,整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异,说明其可能参与了牦牛受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供了基础资料。     

线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响

【目的】试验旨在探究线粒体融合蛋白2(MFN2)基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。【方法】利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列(siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275)和1条阴性干扰序列(siMFN2-Negative);利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数∶细胞个数=100∶1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(BAX)的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;...     

Expression and Localization of Integrin αv in Different Parts of the Fallopian Tube in Reproduction Cycle of Yak

The objective of this study was to explore the expression differences of integrin αv in different parts of the fallopian tube at different reproduction stages of yak, and provide some important theoretical foundations for understanding the effect of integrin αv on the reproductive performance of yak. The samples of the tubal umbrella, ampulla, and isthmus of healthy female yaks (3-6 years old) during follicular, luteal and pregnancy stages were collected, the fallopian tubes of the follicular phase, the luteal phase and the pregnancy phase were divided into 9 groups according to the umbrella, ampulla and isthmus. Real-time PCR (qRT-PCR) and Western-blotting (WB) were used to detect the expression of integrin αv gene and protein. The expression of integrin αv protein was localized by immunohistochemistry. Results: 1) qRT-PCR results showed that, during the follicular phase, the expression of the integrin αv gene in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). During the luteal phase, the expression of the integrin αv gene in the isthmus of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the umbrella and ampulla (P<0.01). During the pregnancy phase, the expression of the integrin αv gene in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). 2) Western-blotting results showed that, during the follicular phase, the expression of integrin αv protein in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). During the luteal phase, the expression of integrin αv protein in the isthmus of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the umbrella and ampulla (P<0.01). During the pregnancy phase, the expression of integrin αv protein in tubal isthmus and umbrella was not significantly different, but these were extremely significantly higher than that in the ampulla (P<0.01). 3) The results of immunohistochemistry showed that integrin αv protein was positively expressed in ciliated cells, secretory cells, basal cells, muscular layers and serous glands of the fallopian tube umbrella, ampulla and isthmus. The results indicated that the expression of integrin αv in different parts of the fallopian tube at different reproduction stages of the yak were significantly different, which showed that αv might be involved in a series of reproductive processes such as fertilization and early embryonic development, the results provided basic information for the study of yak's reproductive performance.     

盐津乌骨鸡MyoG和IGF-1基因表达及其与生长、屠宰性状的相关性分析

为研究肌细胞生成素（myogenin,MyoG）和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）基因表达量对家禽生长发育的影响,试验以体型差异较大的盐津乌骨鸡和大围山微型鸡为材料,分别测定300日龄鸡的体重、体尺和屠宰性状来进行比较分析,检测胸肌、腿肌和肝脏中MyoG和IGF-1基因mRNA的相对表达量,将生长、屠宰性状与基因的相对表达量进行两两相关性分析。结果显示,盐津乌骨鸡体重、体尺和屠宰性状等指标均高于大围山微型鸡,同时盐津乌骨鸡胸肌、腿肌和肝脏中MyoG和IGF-1基因的表达量也高于大围山微型鸡,表达量趋势为：胸肌 > 腿肌 > 肝脏;相关性分析结果显示,两个品种鸡胸肌、腿肌和肝脏中MyoG和IGF-1基因的表达量与体重、体尺和屠宰性状等指标呈显著正相关（P<0.05）,其中MyoG基因的相对表达量与除胸深外的所有性状均呈极显著相关（P<0.01）,而IGF-1基因的相对表达量与体重、体斜长、胸深、胸骨长均呈显著相关（P<0.05）。因此,MyoG、IGF-1基因可作为盐津乌骨鸡和大围山微型鸡的生长性状候选基因来进行选育。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。     

葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

为探究葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的调控作用,在细胞诱导液中分别添加0、10、20、40、60和80 μmol/L葛根素进行成脂诱导分化,用油红O染色法和甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中脂滴聚集情况和甘油三酯含量以考察脂质沉积和分化效果,并确定葛根素的最佳添加浓度;用实时荧光定量PCR检测对照组(0 μmol/L)和最佳葛根素浓度添加组成脂标志基因细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)及成脂分化基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸结合蛋白(FABP4)、应激蛋白(TRIB)和叉头框蛋白O1 (FOXO1)的mRNA的表达水平,用Western blotting检测PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平。结果表明,与对照组相比,20、40和60 μmol/L葛根素均显著增加脂滴和甘油三酯含量(P<0.05),且40 μmol/L葛根素效果最佳;实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著上调成脂标志基因PPARγ、C/EBPα及成脂分化基因ACC、FABP4、FOXO1和TRIB的表达(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著增加PPARγ蛋白表达(P<0.05)。综上所述,40 μmol/L葛根素能够促进松辽黑猪前体脂肪细胞的成脂分化和脂质沉积。     

Effects of Interference and Overexpression of DDR1 on Proliferation and Apoptosis of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

The aim of this study was to investigate the effect of discoidin domain receptor 1 (DDR1) gene on the proliferation, apoptosis and cell cycle of dairy cow mammary epithelial cells through interfering and overexpressing DDR1. The small RNA interference fragment of DDR1 gene and overexpression vector pcDNA3.1-DDR1 were transfected into dairy cow mammary epithelial cells, qRT-PCR and Western blot were used to detect the interference and overexpression efficiency of DDR1; CCK-8 was employed to detect cell proliferation; Flow cytometry was performed to detect the changes of cell cycle and apoptosis (early apoptosis and late apoptosis). qRT-PCR was used to detect the expression of genes related to proliferation and apoptosis. After interfering DDR1 gene in dairy cow mammary epithelial cells, mRNA and protein expression levels of DDR1 were down-regulated by 94% and 30%, respectively; While after overexpressing DDR1 gene, its mRNA and protein expression were up-regulated 68.24 and 1.38 times, respectively. Interfering DDR1 extremely significantly inhibited the proliferation of cells (P<0.01), the ratio of early and late apoptotic cells was extremely significantly increased (P<0.01); the ratio of G1 phase cells in the interference group was extremely significantly increased (P<0.01), and the proportions of S and G2 phase cells were significantly decreased (P<0.01 and P<0.05), which suggested that the cells were blocked in G0/G1 phase. Conversely, overexpression of DDR1 could significantly promote cell proliferation (P<0.05), significantly inhibit the late apoptosis of cells (P<0.05), the proportion of G1 phase cells was extremely significantly decreased (P<0.01), and the proportion of S phase cells was extremely significantly increased (P<0.01), suggesting the enhancement of transition from G1 to S phase. The results of qRT-PCR detection showed that after interfering DDR1, the expressions of BAX and Caspase9 genes were significantly up-regulated (P<0.05), and the expressions of P53 and FAS genes were extremely significantly up-regulated (P<0.01), while the expressions of PCNA and CyclinB1 genes were significantly down-regulated (P<0.05). After overexpression of DDR1, the expressions of Cytc and BAX genes were significantly (P<0.05) and extremely significantly down-regulated(P<0.01), respectively, and the expression of CyclinB1 gene was extremely significantly up-regulated (P<0.01). In summary, DDR1 can regulate the proliferation, apoptosis and cycle of dairy cow mammary epithelial cells, this result will provide a reference for elucidating the molecular mechanism of DDR1 involved in the growth and development of dairy cow mammary epithelial cells.     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

成年牦牛皮肤中血管与神经的组织学观察及HIF-1α在皮肤中的表达

本研究旨在探讨牦牛不同部位皮肤内血管和神经的分布情况,及检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在不同部位皮肤上的定位及相对表达量,探究牦牛皮肤对高原低氧环境的适应机制。采用HE、Masson’s三色和Verhoeff VG染色法,对成年牦牛皮肤内血管和神经结构进行观察与分析;采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法,对HIF-1α的mRNA和蛋白在成年牦牛皮肤组织中表达与分布进行研究。结果表明,颈部血管与神经密度最高,前臂部和小腿部次之,跖部最低,部位间差异显著（P<0.05）。HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊的上皮根鞘、皮脂腺、汗腺、血管、神经;颈部、前臂部和小腿部强阳性表达,跖部阳性表达。HIF-1α mRNA的相对表达量跖部明显低于其他部位（P<0.05）,其他三个部位两两比较差异不显著（P>0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量颈部最高,跖部最低,差异显著（P<0.05）。研究结果提示,成年牦牛不同部位皮肤内不同血管和神经形态结构相似,密度从颈部到前肢再到后肢差异显著。HIF-1α的差异性表达进一步说明皮肤在牦牛适应低氧环境中发挥作用。     

PCV3对仔猪生长相关激素及其功能基因表达的影响

【目的】研究猪圆环病毒3(Porcine circovirus 3,PCV3)对仔猪生长相关激素及其功能基因表达的影响,探索PCV3导致仔猪消瘦的机制。【方法】以8头23日龄的健康断奶仔猪为研究对象,随机均分为PCV3感染组(感染组)、DMEM组,分别从颈部注射3 mL PCV3病毒液(10⁹拷贝/mL)和3 mL DMEM,并于注射前(0 d)及注射后3、7、14、21 d称量仔猪体重,观察其临床表现,采集各组仔猪血清、口腔拭子、鼻腔拭子和肛拭子,采用实时荧光定量PCR检测各样品中PCV3病毒载量;ELISA法测定各组3、7、14、21 d仔猪血清中的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, T₃)、甲状腺素4(thyroxine, T₄)的浓度;实时荧光定量PCR测定背最长肌、腿肌、脾脏、肝脏组织中生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-li...     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

灭活大肠杆菌与脂多糖诱导猪肠黏膜上皮细胞表达RegⅢγ的机理研究

试验旨在探索革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）及其表面分子脂多糖（LPS）诱导胰腺再生蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）表达调控的机制。首先,用不同浓度灭活E.coli（10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5、10、20、40、80 μg/mL）诱导猪肠黏膜上皮细胞（IPEC-JⅡ）,用MTT法测D_{490 nm}值,检测E.coli和LPS对IPEC-JⅡ细胞活力的影响;其次,用不同浓度灭活E.coli（10⁷、10⁶、10⁵ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5 μg/mL）处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测RegⅢγ mRNA和蛋白的表达;最后,用1 μg/mL LPS处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测p65、p38、JNK、ERK mRNA和蛋白表达及磷酸化水平。结果显示,除0.01 μg/mL LPS不抑制IPEC-JⅡ细胞活力外,其他浓度的灭活E.coli和LPS均可抑制IPEC-JⅡ细胞活力,且10⁹、10⁸ CFU/mL E.coli和10、20、40、80 μg/mL LPS组细胞活力极显著下降（P<0.01）;与对照组相比,10⁷、10⁶和10⁵ CFU/mL E.coli均能诱导RegⅢγ表达增加,且10⁵ CFU/mL E.coli组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,蛋白表达量显著高于对照组（P<0.05）;0.01、0.1、1和10 μg/mL LPS均能诱导RegⅢγ表达增加,且0.1和1 μg/mL LPS组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,RegⅢγ蛋白表达虽有增加趋势,但差异不显著（P>0.05）;与对照组相比,1 μg/mL LPS组p65、p38 mRNA表达量极显著增加（P<0.01）,JNK、ERK mRNA表达量显著增加（P<0.05）;同时,p38、JNK蛋白表达量和磷酸化水平均极显著增加（P<0.01）,p65蛋白磷酸化水平显著增加（P<0.05）,ERK蛋白和磷酸化水平均增加,但差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,灭活E.coli和LPS均可诱导RegⅢγ表达,1 μg/mL LPS可增加p65、p38和JNK蛋白的磷酸化水平。