葫芦多糖体外抗鸡新城疫病毒作用的研究

为研究葫芦多糖抗新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） 活性,本试验采用水提醇沉法提取葫芦总多糖及4种分级多糖,通过苯酚-硫酸法及红外光谱对葫芦多糖进行检测,MTT法测定各级多糖对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度,多糖的安全浓度统一定为78.125 μg/mL,以3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加药）,检测葫芦多糖对NDV的阻断、抑制及直接杀灭作用。结果表明,葫芦总多糖及4种分级多糖均具有抗NDV活性,其中对NDV的抑制作用及直接杀灭作用强于对NDV的阻断作用。70%、80%梯度醇沉的葫芦多糖（LSP₇₀、LSP₈₀）及总多糖（LSP_t）,抑制作用下的病毒抑制率分别为40.41%、44.54%、61.85%,杀灭作用下的病毒抑制率分别为44.74%、58.76%和59.38%,阻断作用下对NDV的抑制率,其中LSP₈₀组最高达37.14%,其余各组均低于25%。综上可知,70%、80%梯度醇沉的葫芦多糖及葫芦总多糖的抗NDV活性较好,可作为进一步研究的材料。     

列当多糖对鸡新城疫病毒在鸡成纤维细胞中增殖的抑制作用

为研究列当多糖抗新城疫病毒(NDV)活性,用水提醇沉法提取列当总多糖及4种分级多糖,并通过苯酚硫酸法及红外光谱对列当多糖进行检测。通过MTT法测定各级多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度。以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加药,检测列当多糖对新城疫病毒的阻断作用、抑制作用及直接杀灭作用。结果表明,列当总多糖及4种分级多糖均具有抗NDV活性,其中对NDV的抑制作用及阻断作用强于对NDV的直接杀灭作用。50%、80%梯度醇沉的列当多糖(OSP50、OSP80)及总多糖(OSPt),阻断作用下的病毒抑制率分别为19.50%、33.10%和22.30%,抑制作用下的病毒抑制率分别为19.00%、21.90%和22.60%,杀灭作用下对NDV的抑制率分别为,14.70%、17.50%和13.30%,其余各组多糖阻断作用、抑制作用及杀灭作用下的病毒抑制率均低于上述3组多糖。说明OSP50、OSP80及OSPt的抗NDV活性较好,可以作为进一步研究的材料。     

中药牛皮消多糖体外抗新城疫病毒作用的研究

为探讨牛皮消多糖（CAP）对体外抗新城疫病毒（NDV）能力的影响,本试验用水提醇沉法提取牛皮消多糖,通过苯酚硫酸法和红外光谱对牛皮消多糖进行检测,采用MTT法测定牛皮消多糖对鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度,多糖的安全浓度统一为625 μg/mL,选择安全浓度范围内的（39.06~625 μg/mL）5种浓度的各级多糖,用3种加药方式（先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加药）检测牛皮消多糖对NDV的阻断、抑制及直接杀灭作用。结果显示,先接病毒后加多糖组和多糖与病毒感作后加药组CAP₅₀、CAP₃₀、CAP_t、CAP₈₀和CAP₇₀均能显著抑制NDV感染CEF的能力,两组各级多糖抑制率分别为131.23%、110.12%、108.15%、100.24%、93.07%和61.76%、43.73%、44.51%、29.02%、37.45%;先加多糖后接病毒组CAP₅₀、CAP₃₀能显著抑制NDV感染CEF的作用（P<0.05）,阻断作用下对NDV的抑制率可达到15.82%、8.33%,其余各组在安全浓度范围内对NDV无抑制作用。各组中药牛皮消多糖均有较好的抗NDV活性,其中对NDV的抑制作用和直接杀灭作用强于对其阻断作用。CAP₅₀及CAP₃₀的抗NDV活性较强,可作为进一步研究材料并具备一定的研究价值。     

中草药在鸡胚成纤维细胞(CEF)上对新城疫病毒的作用研究

分离并培养鸡胚成纤维细胞(CEF),并感染新城疫病毒(NDV),通过观察细胞病变,检测在CEF上,复方中草药对NDV的影响。结果表明,中草药对新城疫病毒的中和、预防、治疗作用的最小抗病毒浓度分别是0.061mg/ml、0.244mg/ml、0.976mg/ml。     

甘草多糖和甘草酸对NDV感染鸡胚成纤维细胞能力的影响

从甘草中提取甘草多糖和甘草酸,进行抗病毒活性比较。用MTT法比较了它们对鸡胚成纤维细胞(CEF)生长及以三种加药方式(先药后毒、先毒后药、药毒同时)抵抗新城疫病毒(NDV)感染细胞的影响,并用平均病毒抑制率比较甘草多糖和甘草酸的抗病毒活性。结果表明,先药后毒,甘草多糖能显著抑制NDV感染细胞(P0.05),平均病毒抑制率为60.6%;先毒后药,甘草多糖和甘草酸都能显著抑制NDV感染细胞(P0.05),其中甘草多糖的平均病毒抑制率为74.28%,甘草酸为62.3%。通过平均病毒抑制率比较,表明甘草多糖的抗病毒活性优于甘草酸。     

复方中药体外抗新城疫病毒活性研究

为了筛选出高效的抗新城疫病毒中药,采用鸡胚接种试验,对8种经典清热解毒复方中药的抗新城疫病毒效果进行了测定。结果表明,荆防败毒散、银翘散、白头翁汤、双黄连口服液在体外对新城疫病毒具有较好的抑制作用。     

柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及新城疫病毒抑制作用的初步研究

目的:初探柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用及其机制,温度、酸碱度对提取物作用的影响;观察柠檬提取物对新城疫病毒的抑制作用。方法:利用滤纸片扩散法测定不同提取物浓度的相对抑菌活性,不同温度、酸碱度环境提取物相对抑菌活性。利用Vero细胞为载体观察提取物对新城疫病毒的抑制作用。结果:柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有显著的抑菌活性,其活性不受酸碱度影响,但受温度影响;提取物对新城疫病毒具有直接抑制作用,对该病的预防及治疗作用则不明显。结论:柠檬提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及新城疫病毒均具抑制作用。     

Characterisation of genotype VII Newcastle disease virus (NDV) isolated from NDV vaccinated chickens,and the efficacy of LaSota and recombinant genotype VII vaccines against challenge with velogenic NDV

A Newcastle disease virus (NDV) isolate designated IBS002 was isolated from a commercial broiler farm in Malaysia. The virus was characterised as a virulent strain based on the multiple basic amino acid motif of the fusion (F) cleavage site ¹¹²RRRKGF¹¹⁷ and length of the C-terminus extension of the hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Furthermore, IBS002 was classified as a velogenic NDV with mean death time (MDT) of 51.2 h and intracerebral pathogenicity index (ICPI) of 1.76. A genetic distance analysis based on the full-length F and HN genes showed that both velogenic viruses used in this study, genotype VII NDV isolate IBS002 and genotype VIII NDV isolate AF2240-I, had high genetic variations with genotype II LaSota vaccine. In this study, the protection efficacy of the recombinant genotype VII NDV inactivated vaccine was also evaluated when added to an existing commercial vaccination program against challenge with velogenic NDV IBS002 and NDV AF2240-I in commercial broilers. The results indicated that both LaSota and recombinant genotype VII vaccines offered full protection against challenge with AF2240-I. However, the LaSota vaccine only conferred partial protection against IBS002. In addition, significantly reduced viral shedding was observed in the recombinant genotype VII-vaccinated chickens compared to LaSota-vaccinated chickens.     

鸡马立克病毒流行强毒株的致弱研究

针对马立克病毒(MDV)毒力逐渐上升的现状,本研究对国内MDV流行强毒株进行了致弱研究。本实验采用近年来从东北、四川2地区免疫发病鸡场中分离的4株MDV流行强毒株(L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY),经噬斑纯化后,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养至75代～85代,获得了4株高代次细胞毒株(L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C)。并分析了L-SYp85C和L-MSp75C毒株的体外、体内生长特性和对SPF鸡的致病力。结果表明,L-SYp85C和L-MSp75C株在CEF适应性显著提高;以10倍感染剂量感染的SPF鸡,在12周内均未发生MD肿瘤,体重平均值与对照组体重平均值差异不显著;检测7d～45d羽髓中病毒载量,均低于106copies/106cell,显著低于亲本毒株。同时,4株传代毒株132bpr基因拷贝数显著增加。上述结果为MDV强毒株的致弱研究以及进一步筛选MDV弱毒疫苗株提供了实验依据。     

中药成分对传染性法氏囊病毒感染细胞的影响

将黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂甙、人参皂甙等 1 0种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)以 3种顺序加入到培养 2 4h的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。即先加中药后接种病毒、先接种病毒后加中药、中药和病毒同时加入 ,观察细胞病变的程度 ,以评价它们对IBDV感染细胞的影响。结果表明 ,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时 ,多数中药成分处理组在病毒接种后 72h的细胞病变程度明显减轻 ,表明多数中药能抑制病毒感染细胞 ,且有一定的量效和时效关系。     

复方金银花对鸡体内NDV分布的影响

选用1日龄雏鸡,无污染环境饲养21 d后,随机分成感染组、中药治疗组、空白组。中药治疗组饮水给予复方金银花制剂。以单克隆抗体介导的免疫组化（IHC）法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,以确定复方金银花对新城疫病毒感染鸡的组织嗜性的影响。结果显示,感染组和中药治疗组鸡的16个组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒以气管、肺脏、十二指肠、空肠等器官中分布为最高。复方金银花对新城疫的组织损伤有一定的保护作用,可缩短组织修复的时间。     

一株肉鸽强毒新城疫的分离鉴定和分子特性分析

从山东地区发病肉鸽中分离到一株新城疫病毒(SDZ08),经测定,其鸡胚半数致死量(ELD50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种的致病指数(IVPI)分别为107.85、52.5h、1.8、2.2,表明该新城疫病毒为强毒.通过分析其融合蛋白(F)发现,F蛋白多肽裂解位点为112RRQKRF117,符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列.F基因分型及氨基酸同源性比较发现,SDZ08株属于基因Ⅵ,与La Sota、F48E9、B1、V4等传统毒株同源性较低,与鸽源NDV同源性较高.     

利用RNAi技术靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制

构建了针对新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi质粒;转染质粒36 h后接种NDV,通过对病毒滴度测定、实时荧光定量PCR和细胞病变结果分析,表明其能抑制NDV在CEF中的复制和增殖.本试验为进一步研究NDV复制机理和抗病毒治疗提供了技术基础.     

鸭新城疫病毒和流感病毒多重RT-PCR鉴别诊断技术的建立和应用

对同样以引起鸭产蛋下降为主要特征的鸭流感病毒（AIV）分离株和鸭新城疫病毒（NDV）YH99V分离株，通过设计特异性引物和优化体系反应条件，建立了一种早期快速鉴别诊断鸭AIV和鸭NDV的单项RT—PCR方法和多重RT—PCR方法，AIV的扩增片段大小为483bp，NDV的扩增片段为310bp，电泳快速，易于区分。敏感性试验表明，该方法比HA敏感100倍以上；对AIV、YH99V、IBV、IBDV及正常鸡胚尿囊液的混合液检测显示，多重RT—PCR法具有很强的特异性。对鸭病毒性产蛋下降征侯群送检病料的检测证明，该方法能有效鉴别AIv和／或NDV单独感染或混合感染，阳性检出率明显高于HA方法。     

VA5免疫增强剂对鸽新城疫病毒灭活疫苗的增效作用研究

试验旨在探究VA5免疫增强剂对鸽新城疫病毒（NDV）灭活疫苗（ND4416株）的免疫增效作用。选取160只健康鸽随机分为4组：ND4416株灭活疫苗组（NDV组）、ND4416株灭活疫苗与免疫增强剂（VA5）混合组（NDV+VA5组）、La Sota灭活疫苗组（La Sota组）及生理盐水空白对照组（C组）,进行免疫效力及免疫持续期试验。采用血凝抑制试验检测各组鸽免疫后不同时间点的血清抗体效价,结果显示,VA5免疫增强剂能够显著提高鸽NDV灭活疫苗血清抗体水平（P<0.05）。脾脏淋巴细胞转化试验结果显示,VA5能够有效刺激免疫鸽的淋巴细胞转化。在免疫后第30、90、180天,各组鸽子采用ND4416株进行攻毒试验,结果显示,NDV+VA5组在3个时间点的攻毒保护率均为100%,均高于La Sota组。免疫持续期试验结果显示,NDV+VA5组血清抗体水平在免疫后第21天达峰值11.20log₂,第180天仍能达到7.50log₂,攻毒保护率达100%,表明VA5免疫增强剂可延长鸽新城疫疫苗的免疫效力持续期至180 d。攻毒后体外排毒检测结果表明,VA5免疫增强剂能够缩短攻毒后鸽的体外排毒周期,减少体外排毒。综上,VA5免疫增强剂能够显著提高鸽NDV灭活疫苗的免疫效果,为研制效果更好的鸽NDV疫苗提供了基础依据,同时也为免疫增强剂的应用增加了试验数据。     

Study on Synergistic Effect of VA5 Immunopotentiator on Pigeon NDV Inactivated Vaccine

This study was designed to evaluate the synergistic effect of VA5 immunopotentiator on pigeon ND4416 inactivated vaccine.160 healthy pigeons were randomly divided into four groups,including ND4416 strain inactivated vaccine group (NDV group),ND4416 strain inactivated vaccine and immunopotentiator (VA5) mixed group (NDV+VA5 group),La Sota inactivated vaccine group (La Sota group) and normal saline as the control group (C group),to assess their vaccine efficacy against virulent pigeon NDV by serological analysis and animal testing.Pigeons sera were collected at different time points after immunization and measured the HI antibody titer of each group.The results showed that VA5 immunopotentiator significantly improved the serum antibody level of pigeons immunized with pigeon Newcastle disease inactivated vaccine (P<0.05).In addition,comparative test of spleen lymphocyte transformation was conducted at various time points after immunization.The results indicated that VA5 effectively stimulated the lymphocyte transformation of immune pigeon.Pigeons in each groups were challenged with ND4416 strain at the 30th,90th and 180th d after immunization.The results presented that the NDV+VA5 group had 100% protection rate and higher than La Sota group.The duration of immunization test showed that the antibody titer of NDV+VA5 group reached peak 11.20log₂ at the 21st d,remained 7.50log₂ at 180th d,and the protection rate remained 100% at 180th d.It indicated that VA5 immunopotentiator sustained the immune duration of pigeon NDV vaccine up to 180 d.Moreover,the in vitro detoxification test results suggested that VA5 immunopotentiator reduced the in vitro detoxification cycle of pigeons after challenge.Overall,this study suggested VA5 immunopotentiator could significantly improve the immune efficacy of pigeon Newcastle disease inactivated vaccine,which provided a basis for further enhancing the efficacy of Newcastle disease vaccine,as well increased experimental data for the application of immunopotentiators.     

高NDV抗体水平下种鸡场新城疫自净化技术的初步研究

为探索高NDV抗体水平下新城疫自净化技术,评估在新城疫净化状态下的鸡群生产性能及经济效益,针对某大型养鸡场的A5、B5两栋鸡舍,通过加大免疫密度和提高免疫剂量,逐步提高NDV抗体水平,在开产前建立了高NDV抗体水平鸡群。对两组鸡群整个生产过程的排毒情况进行跟踪检测,统计鸡群整个生产过程的产蛋率、死淘率等情况,估算净化效益。结果显示,实际生产中,在良好的饲养管理基础上,提高NDVHI抗体水平到12log2以上,可达到完全保护;建立的高NDV抗体水平种鸡群,B5舍在34周龄基本达到净化状态,A5舍在38周龄后达到净化状态,实现了新城疫的自净化;达到完全净化状态的种鸡群,可增加经济效益约为161420元/万只。     

新城疫病毒F48E8株cDNA文库的构建

以新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒株为材料，分别用基因组ＲＮＡ及ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ。将ｃＤＮＡ通过同聚物加尾ｐｏｌｙ（ｄＣ）后克隆于末端加有ｐｏｌｙ（ｄＧ）的线性化质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）上，转化大肠杆菌ＴＧ１，经ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ筛选及电泳检查，其中有５６个克隆含有大小在０．２～２．７ｋｂ范围的外源片段。斑点杂交鉴定有５２个是ＮＤＶｃＤＮＡ克隆，平均长度为１．３１ｋｂ，从而构建了ＮＤＶｃＤＮＡ文库。文库的统计学质量检验表明，拥有５２个克隆的Ｆ４８Ｅ８株ｃＤＮＡ文库可能覆盖ＮＤＶ整个基因组     

新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作用

本试验将不同浓度的新城疫D90病毒株感染肺癌A549细胞,光学显微镜下,分别在24h、48h、72h观察细胞形态,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法在不同感染时间,对不同浓度D90作用下的肺癌细胞A549进行细胞生长状况的检测。结果表明,在24h的时间内,不同浓度(1×10-1～1×10-4)的D90毒株作用下的细胞形态学变化具有一个共同的特征:小的气泡出现,且细胞发生圆缩,这是典型的凋亡形态学变化。在48h～72h时间段内,细胞迅速且大量崩解、坏死。在MTT试验中,新城疫病毒D90株对A549肺癌细胞产生了明显的抑制作用,不同浓度的D90毒株对A549肺癌细胞的作用差异较为明显,抑制率随着病毒浓度的增加而增大,即抑制率与病毒的浓度呈正相关。     

荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究

本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光RT-PCR方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光RT-PCR方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光RT-PCR检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光RT-PCR的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光RT-PCR方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。