B细胞抗原表位预测方法的研究进展

抗原表位是抗原分子的主要功能单位。B细胞抗原表位的准确定位对疫苗设计、诊断试剂的研发及高通量抗体的制备均具有重要意义。作者对目前常用的B细胞线性表位预测方法和B细胞构象表位预测方法进行概述,并对不同预测方法进行比较,旨在为病原微生物抗原表位研究提供一定的理论参考。     

细胞的抗原表位研究方法

多表位疫苗有望成为预防多种病原体感染的理想疫苗,因而被认为是将来疫苗的发展方向。抗原表位是研究抗原的免疫机制和表位疫苗的基础,近年来在表位研究方面取得了一些可喜的进展,特别是抗原表位的研究方法。B细胞表位的研究方法已经不局限于通过交叠合成多肽进行研究,又诞生了噬菌体随机肽库以及表位预测等方法;在T细胞抗原表位的研究方面也有了相应的预测方法,尤其是将ELISPOT试验、体外抗原提呈试验等应用于T细胞表位活性的鉴定,极大的促进了T细胞表位的研究进展。文章全面系统地对B细胞表位与T细胞表位的研究方法的进展进行了综述。旨在为表位和表位疫苗的研究提供先进的多种技术方法。     

H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白线性表位的预测与鉴定

应用生物信息学方法预测H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)线性抗原表位,并对所获表位的免疫原性进行初步鉴定,为流感病毒表位疫苗研制和H6亚型特异性ELISA检测方法奠定基础。依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H6、H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列。利用DNA Star软件进行H6同亚型间氨基酸序列保守性分析,再将H6与H5、H7、H9不同亚型之间氨基酸同源性进行比较,然后借助在线服务器ExPASy和IEDB对序列进行抗原性、亲水性、柔韧性、二级结构和表面可及性预测。最后去除H6与H5、H7、H9亚型氨基酸同源区域,选择H6亚型氨基酸相对保守区域并且抗原表位综合预测结果较优的几个片段,所选择表位长度为15个氨基酸。合成所获得的优势线性表位,并用间接ELISA方法对所获表位的免疫原性进行鉴定。预测后获得4个线性抗原表位,经鉴定免疫原性最好的为表位A,最差的为表位B。     

新型多肽表位技术研究进展

多肽表位作为抗原的重要组成成分,可以被宿主免疫系统B细胞产生的抗体（Ig）和T细胞受体（TCR）识别,从而诱导机体产生免疫保护作用。传统的研究方法如交叠肽合成等费时费力,极大地限制了多肽表位的研究。随着生物信息学、高通量测序、CRISPR/Cas9、质谱（MS）等技术出现以及TAP非依赖型蛋白加工机制的不断阐述,使表位的研究得到不断完善。作者介绍了最新的多肽表位研究方法,包括利用计算机对B细胞和T细胞表位的预测、基于MHC与抗原肽结构作用为基础的方法、结合高通量测序技术的表位筛选方法、结合新型基因编辑技术的表位筛选方法、TAP非依赖性T细胞表位的最新研究等,并对今后多肽表位研究的发展进行了展望。     

抗原表位鉴定方法的研究进展

抗原表位是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团,一般由几个氨基酸残基序列或其空间结构组成。它是引起免疫应答的物质基础,其性质决定了抗原的特异性。抗原表位的鉴定方法主要有肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、X-ray衍射或核磁共振技术、质谱技术、噬菌体展示肽技术及生物信息技术预测等,文章将从这几方面入手对近几年来鉴定抗原表位的方法作一综述。     

Research Progress on Novel Peptide Epitopes Technology

As an important component of the antigen, peptide epitopes can be recognized by T cell receptor (TCR) and antibodies which induced protective immunity by the host immune system. Traditional research methods, such as overlapping peptide synthesis is long time-consuming which greatly limits the study of epitopes. With the development of bioinformatics, high-throughput sequencing, CRISPR/Cas9 technology, MS and other technologies and explaining the processing mechanism of TAP-dificient protein constantly, the research for epitopes is being perfect continually. In this article, some new methods to study epitopes were introduced, including computer prediction of B cell or T cell epitopes, identification of epitopes based on the structure and interaction of MHC and antigenic peptides, screening epitopes by means of high throughput sequencing, screening epitopes by means of newly genome editing, the up-to-date research in TAP-deficient T cell epitopes, etc. Finally,future prospect for research direction of peptides was further forecasted.     

抗原表位研究方法进展

抗原表位是抗原分子中的主要功能单位,能有效刺激机体的细胞免疫和体液免疫。随着免疫学和生物信息学技术的不断发展,用于研究T细胞表位和B细胞表位的方法得到了很大的提高。论文中概述了近几年用于研究T细胞表位的预测方法和鉴定方法,以及在B细胞表位研究中所用的表位肽扫描技术、蛋白质"切割"法、噬菌体展示技术、X-衍射与核磁共振、表位预测方法等技术,并对每种研究方法进行了比较,为从事抗原表位研究的人员提供参考,从而更有利于表位肽疫苗的研制和诊断方法的建立。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位研究进展

根据病毒表位与受体细胞结合部位的差异可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原表位的研究已有大量报道,论文根据PRRSV的基因组结构蛋白和非结构蛋白基因编码区特点,对鉴定的PRRSV相关抗原表位进行简要综述,为进一步开发PRRSV快速鉴别诊断方法和多表位疫苗奠定基础。     

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。     

马疱疹病毒1型gB糖蛋白线性B细胞表位的预测与鉴定

试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒1型（equine herpesvirus 1,EHV-1） gB糖蛋白,预测B细胞表位,筛选出具有潜在诊断价值的线性B细胞表位。将EHV-1 gB糖蛋白的基因序列输入DNAStar软件中的Protean工作区中,经参数综合比较分析筛选潜在的B细胞表位,克隆、表达预测表位的基因片段,利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应。经预测分析,gB糖蛋白的B细胞表位可能位于第6-10、23-32、53-65、72-98、111-120、152-166和173-180位氨基酸区域。本试验成功构建并原核表达含7个潜在B细胞表位的融合蛋白。Western blotting试验结果显示,其中5个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别。本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到5个潜在的B细胞表位,为EHV-1表位诊断、表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础。     

Prediction and Identification of Linear B-cell Epitopes in gB Glycoprotein of Equine Herpesvirus Type 1

The study was aimed to predict B cell epitopes in gB glycoprotein of equine herpesvirus type 1 (EHV-1) with bioinformatics, and select epitopes which had potential diagnostic value. The DNA fragments of gB glycoprotein were predicted by protean of DNAStar software. Screening potential B cell epitopes after parameter comparison, the target B cell epitopes were selected, cloned and expressed. The expressed fusion proteins serviced as an antigen were used to react with equine herpesvirus positive serum to screen and identify antigenic epitopes. The results showed that according to predictive and analysis, the areas of amino acid from 6 to 10, 23 to 32, 53 to 65, 72 to 98, 111 to 120, 152 to 166, 173 to 180 might be gB glycoprotein B cell epitopes. Seven epitopes were successfully cloned into a prokaryotic expression vector, and confirmed by DNA sequencing. After expression and purification, Western blotting was performed to detect the antigen, which could be recognized by equine herpesvirus positive sera. Bioinformatics technology and molecular biology techniques were used to successfully screen five potential B cell epitopes, which provided the foundation for the diagnosis of EHV-1 and design of the epitope vaccine.     

鹅细小病毒非结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定及抗原表位区分子特性分析

为进一步对鹅细小病毒(GPV)非结构(NS)蛋白B细胞线性抗原表位进行定位,本研究设计了覆盖NS1蛋白C末端453 aa～627 aa的7个长约30个氨基酸残基的重叠短肽,并进行了融合表达。蛋白质印迹分析结果表明,表达的融合蛋白NSb(485 aa～514 aa)、NSc(498 aa～532 aa)、NSd(523 aa～556 aa)、NSe(543 aa～573 aa)、NSf(564 aa～598 aa)和NSg(599 aa～627 aa)能够被GPV免疫的鹅血清识别。将抗原表位区推导氨基酸序列与GenBank中登录的12株GPV和番鸭细小病毒(MDPV)相应序列应用DNAMAN进行同源性比较,并构建了系统进化树。分析结果表明,GPV各株之间的同源性较高,但在强弱毒株和不同地区分离株中存在一定的差异。同时,GPV和MDPV的NS蛋白中可能存在共同的线性抗原表位区。     

Fine mapping and conservation analysis of linear B-cell epitopes of peste des petits ruminants virus nucleoprotein

Nucleoprotein (NP) is the most abundant and highly immunogenic protein of morbillivirus, and is presently the basis of most diagnostic assays for peste des petits ruminants virus (PPRV). In this study, fine epitope mapping and conservation analysis of linear B-cell epitopes on the PPRV NP has been undertaken using biosynthetic peptides. Nineteen linear B-cell epitopes were identified and their corresponding minimal motifs were located on the NP of PPRV China/Tibet/Geg/07-30. Conservation analysis indicated that ten of the 19 minimal motifs were conserved among 46 PPRV strains. Peptides containing the minimal motifs were recognized using anti-PPRV serum from a goat immunized with PPRV vaccine strain Nigeria 75/1. Identified epitopes and their motifs improve our understanding of the antigenic characteristics of PPRV NP and provide a basis for the development of epitope-based diagnostic assays.     

福建省部分地区鹦鹉喙羽病的分子流行病学调查及其病原Cap蛋白抗原表位预测

为了解2017—2018年鹦鹉喙羽病在福建省某些地区鹦鹉中的流行情况,收集了福建省部分地区298份鹦鹉粪便样品,采用PCR方法进行粪便样品检测,对其中鹦鹉喙羽病病毒检测呈阳性的5个地区的样品进行衣壳蛋白(Cap)基因测序后比较其同源性,绘制系统进化树,分析氨基酸序列,并通过生物信息学及序列分析软件预测Cap蛋白二级结构及B细胞抗原表位。结果显示:鹦鹉喙羽病病毒的平均阳性率为41.28%,福州市某动物救助站和福州动物园的阳性率较高,分别为65.17%和64.29%,其次为三明动物园、福州市花鸟市场和福州市某鹦鹉繁殖基地,南平动物园的阳性率最低;所测5个毒株Cap基因与GenBank中新西兰株(AY518913)亲缘关系较近;Cap蛋白有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区域,具有潜在的B细胞抗原表位,位于5~27、110~127和141~153位氨基酸残基或其附近。研究结果对防控鹦鹉喙羽病,保障鹦鹉健康养殖有重要参考意义。     

基于免疫信息学方法设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒S、M及E蛋白的多表位疫苗

【目的】设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV) S、M及E蛋白的多表位疫苗。【方法】本研究选用IEDB预测SADS-CoV S、M及E蛋白T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Serve预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用Immunomedicine Group、IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出重叠表位区域作为优势表位,运用IEDB、AllerTOP v 2.0 Servers筛选出高保守性、非致敏性的优势表位区域,通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,最后进行基因克隆。【结果】经筛选后的高保守性、非致敏性优势表位构建的多表位疫苗相对分子质量为35.30 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在1个N-糖基化位点,在二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和β-转角分别占22....     

斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析

试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白（glycoprotein，GP）抗原基因，并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA，反转录合成cDNA，设计特异性引物以扩增GP基因CDS区，同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序，并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明，GP基因开放阅读框（ORF）全长1 149 bp，编码382个氨基酸，其分子式为C₁₇₆₀H₂₈₇₈N₄₅₈O₅₉₀S₁₇₆₀，理论分子质量约为40.15 ku，等电点为4.37，无信号肽，总平均亲水性为0.032，不稳定系数为42.43，是疏水、不稳定蛋白；其磷酸化位点分布位于丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上；二级结构分析显示，斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主，与三级结构预测结果一致；抗原表位预测表明，GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位，有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因，同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测，为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。     

羊传染性脓疱病毒湖北分离株CBP二级结构及其细胞表位的预测

参照GenBank中羊传染性脓疱病毒（Orf virus,ORFV）的毒力因子趋化因子结合蛋白（chemokine-binding protein,CBP）基因的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以羊传染性脓疱病毒湖北分离毒株的DNA为模板,提取总DNA。采用PCR方法特异扩增该基因片段,得到CBP基因序列。通过网络平台的SOPMA服务器和DNAStar软件预测ORFV CBP蛋白的二级结构;综合利用DNAStar软件、二级结构预测及ABCpred方案预测羊ORFV CBP蛋白的B细胞表位;分别采用人工神经网络法（ANNA）和在线程序预测ORFV CBP蛋白的细胞毒性T细胞和辅助T细胞的抗原表位。结果显示,ORFV CBP蛋白的二级结构主要包括α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和β-片层4种类型,分别为α-螺旋占24.64%、β-片层占22.14%、β-转角占3.39%、无规则卷曲占49.29%;有7个优势B细胞表位,7个细胞毒性T细胞表位和3个辅助T细胞表位。本研究为ORFV诊断方法的建立、单克隆抗体的制备及表位疫苗的研制提供了理论依据。     

鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

利用DNAStar软件包中的Editseq将GPV H1株非结构蛋白和结构蛋白核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,分别预测结构蛋白和非结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位。结果表明,GPVH1株非结构蛋白和结构蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,其中非结构蛋白的NS2和结构蛋白的VP3含有较多的潜在的B细胞优势抗原表位。     

合成肽ELISA试验中肽抗原序列的筛选

讨论了在研究合成肽ELISA诊断试验中,选择适当的抗原表位氨基酸序列作为多肽合成的序列模板时,需要考虑的主要因素,以提高ELISA试验过程中的合成肽抗原的包被效果。     

羊口疮病毒B2L蛋白抗原表位预测及重组蛋白设计与验证

为得到羊口疮病毒（ORFV）B2L蛋白的可能抗原表位及截短后高效表达的表位蛋白，本试验采用DNAStar、Mega 7.0等软件对部分NCBI已登录的B2L基因序列进行分析，并应用不同在线服务器对其编码蛋白的信号肽、跨膜区、细胞毒性T细胞表位、辅助性T细胞表位、B细胞表位和二级结构进行预测，同时参考多模板进行三级结构预测，综合抗原表位、亲水性、表面可及性和抗原指数等主要预测数据进行抗原位点分析及融合His·tag抗原表位蛋白的设计，构建并原核表达截短后高效表达的表位蛋白。结果显示，得到了几个可能的优质抗原表位，分别为88-93、133-138、172-175、251-254、311-313和370-377位氨基酸；纯化并复性的蛋白以多聚体形式存在；Western blotting结果显示，其具有良好的反应原性。该研究确定了ORFV B2L蛋白抗原位点，构建并原核表达了截短后高效表达的表位蛋白，为羊口疮诊断制剂及亚单位疫苗的研究奠定了基础。