猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了给天津某规模猪场提供猪传染性胸膜肺炎(PCP)的科学防控和合理的用药方案,本试验对该猪场疑似患PCP的病猪进行临床综合诊断和病理组织学观察,无菌采集病料,通过细菌的分离与培养、镜检、生化试验、卫星试验、PCR检测、动物致病性试验及药敏试验等实验室方法对分离菌进行系统分析。结果发现,病猪呼吸困难,病理剖检和病理组织学观察可见有典型的纤维素性肺炎变化;显微镜下分离菌呈多形性的革兰氏阴性杆菌,且其生化试验、卫星试验结果与传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)特性一致;用APP APX ⅣA毒素基因特异性引物扩增结果为阳性;该APP分离菌对小鼠具有致病性,且对头孢噻肟、氟苯尼考等药物高度敏感。根据实验室检测结果并结合临床综合诊断,最终判定该细菌分离株为猪传染性APP。     

洛阳某猪场猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

为确定洛阳某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎的病原种类及其血清型,为其临床科学防疫和合理用药提供参考方案,本试验无菌采集了病猪肺脏等病料,采用病菌培养后形态观察、革兰氏染色、生理生化特性试验、PCR诊断等技术对病原菌进行实验室分离鉴定,通过基因测序和同源性分析方法对其进行确诊,通过动物攻毒试验和药敏试验分析分离菌株的致病性和耐药性,采用5对分型引物对分离菌进行基因分型以确定病原菌血清型。结果显示,分离菌2007菌落形态为光滑、透明、边缘整齐、圆形、隆起的小菌落,革兰氏染色特征为阴性杆菌且呈多型性,具有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）的典型培养特征,且生化结果符合猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的生化特性。同源性分析结果显示,分离菌株2007与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌株FJ848573.1同源性为99.4%,说明分离株2007是猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。动物攻毒试验结果显示,分离菌株2007对小鼠有强致病性。药敏试验结果显示,分离株2007对泰妙菌素、氨苄西林和头孢噻呋钠等高敏,对替米考星、红霉素、氟苯尼考等20种抗菌药完全耐药,对34种抗生素的耐药率高达76.5%,具有较强的多重耐药性。分离菌2007基因分型扩增到目的基因片段与血清型5型结果相符。本试验结果为发病猪场提出了解决该病的具体防治措施,并最终获得了良好的效果,为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌临床耐药折点的制定提供了一些参考。     

广东省猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及耐药表型和耐药基因检测与分析

【目的】了解广东省部分规模化猪场引起猪传染性胸膜肺炎(PCP)的病原菌猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的耐药表型和耐药基因携带情况,并分析比较其相关性,为有效防控该病提供理论依据。【方法】将2019-2021年从广东省不同地区规模化猪场采集的疑似猪传染性胸膜肺炎病死猪病料通过病原分离培养、革兰氏染色、生化试验、PCR扩增等方法进行病原菌分离鉴定和测序分析,随后对分离株进行药敏试验并通过PCR检测其耐药基因,确定其耐药表型和耐药基因的携带率,分析比较两者的一致性。【结果】分离菌需在含有血清和NAD的培养板中生长;革兰氏染色结果显示分离菌为红色,可判定为革兰氏阴性细菌,通过生化试验、PCR结果及测序分析确定分离到20株APP,且没有表现出明显的地域特性。所有菌株均呈现多重耐药且约50%菌株呈8重及以上耐药;其中对四环素类、磺胺类、氯霉素类和大环内酯类药物耐药率较高,分别为77.5%、65.0%、55.0%和48.8%;进一步分析发现,分离菌主要对四环素、磺胺异噁唑、氟苯尼考和林可霉素等抗菌药物耐药,而对头孢唑啉(先锋Ⅴ)和阿奇霉素敏感。23种主要耐药基因中共检测到bla_CMY、aph(2″)-Ⅰb、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetM、tetO、tetR和floR这11种耐药基因,携带率分别为85%、85%、50%、60%、75%、30%、100%、85%、100%、70%和80%;未检测到喹诺酮类、大环内酯类和林可胺类相关耐药基因。【结论】从广东省猪群中分离到的APP表现出广泛耐药性,且为多重耐药,耐药基因与耐药表型基本一致,表明耐药基因的携带是细菌对抗菌药物产生耐药的主要原因之一,但也可能存在其他未检测的耐药基因,或存在新的耐药机制。     

Molecular Identification and Antimicrobial Susceptibility Test of Porcine Contagious Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 3

In order to understand the serotype and drug resistance of porcine contagious Actinobacillus pleuropneumoniae(APP), a pair of primers was designed according to GenBank database to amplify specific 950 bp fragment, and the molecular identification and antimicrobial susceptibility test of APP serotype 3 were investigated.The results showed that the PCR product sequences were more than 99% homology with the APP serotype 3 published in GenBank.The isolated strains were highly resistant and multiple drug resistance.The molecular identification and antimicrobial susceptibility test of APP serotype 3 provided the basis for the identification, diagnosis and prevention of porcine contagious pleuropneumonia.     

猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清3型分子鉴定及药敏试验

为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的血清型及耐药情况,本研究根据GenBank数据库设计1对引物,特异性的扩增950 bp核苷酸片段,对血清3型APP进行分子鉴定及药敏试验。结果显示,所得PCR产物经过测序,与GenBank已发表的血清3型APP的同源性达99%以上,所分离菌株耐药性较强,大多为多重耐药。通过对血清3型APP进行分子鉴定及药敏试验,为猪传染性胸膜肺炎的鉴定、诊断及防制提供了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株的分离鉴定及耐药性研究

为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10⁸ CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10⁹ CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

采用巧克力琼脂平板从贵州省某养猪场发病猪体分离到3株细菌,经培养特性观察、生化特征检查和血清型鉴定,确定3株分离菌均为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型。经药敏试验显示,分离菌对氨苄西林、硫酸庆大霉素、丙氟哌酸、氟哌酸、头孢三嗪和四环素等药物高度敏感。     

猪胸膜肺炎放线杆菌四川株的分离鉴定及药物敏感性试验

从四川某猪场疑似胸膜肺炎放线杆菌感染的病料中分离到一株革兰氏阴性小球杆菌。经染色镜检、生化试验、PCR检测、血清型检测,致病性试验和药敏试验,鉴定该菌为猪胸膜肺炎放线杆菌1型,且具有较强致病性。药敏试验结果表明,该菌对四环素、甲氧苄啶,以及链霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素等氨基糖苷类药物高度耐药,对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林和恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类受试药物敏感。     

胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR检测

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的危害养猪业的五大疾病之一。至目前为止App共报道有2个生物型15个血清型。所有型都可能致病，但有显著差异。使用血清学方法监测猪传染性胸膜肺炎有其局限。一些猪细菌分离培养阳性，但血清反应仍为阴性，对这些猪群只能使用病原分离进行确诊。亚临床感染及处于潜伏期的动物，     

胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测可疑病料中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,针对App的RTX毒素(ApxⅣA毒素)毒力基因长约449 bp的片段设计引物,以App 10个血清型的基因组分别作为模板,对PCR扩增条件进行优化筛选,并进行了特异性及重复性试验。对副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌的扩增结果为阴性,表明该PCR方法特异性强,建立了该菌的种属特异性PCR方法。以筛选出的优化条件,对22份临床可疑病料进行了检测。结果表明,建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感,优于传统的细菌学方法,可作为App可疑病料的检测方法。     

套式PCR和实时荧光PCR在检测胸膜肺炎放线杆菌上的应用

应用胸膜肺炎放线杆菌套式PCR和实时荧光PCR检测方法分别检测了不同来源的猪鼻拭子、肺、扁桃体等494份样品。套式PCR 77份阳性,实时荧光PCR 62份阳性,前者的阳性完全覆盖了后者的阳性,两者符合率为97%(479/494)。2种方法均可应用于猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

从山东省泰安市采集的38份具有严重呼吸道症状的病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,其中14株菌株表现出形态多样性、革兰氏染色阴性等特点,小鼠试验显示有较强的毒力,PCR电泳结果得到了650bp的预期目的片段。系统的生物学鉴定表明,这14株分离菌为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneaumoniae,APP)。对确诊的14株APP采用凝集试验进行血清型检测。结果从山东省泰安市分离到14株2个血清型的胸膜肺炎放线杆菌,其中,血清7型8株、血清5型6株,血清7型、5型为绝对优势血清型。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的套式PCR检测

根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)apxⅣA毒素基因的序列,设计了两对特异性引物P1/P4和P6/P8,建立了检测APP全部15个血清型的套式PCR方法.对APP的15个国际标准血清型和国内的APP菌株进行了PCR检测,都能得到223 bp的特异性扩增产物;检测的灵敏度可达1.3 CFU,最低检出DNA浓度为9 fg.     

利用菌落多重PCR对传染性胸膜肺炎放线杆菌进行血清分型

参照文献报道的传染性胸膜肺炎放线杆菌的特异基因合成5对特异引物,建立传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的菌落多重PCR方法,结果为10株传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对41株传染性胸膜肺炎放线杆菌分离菌株进行血清型分型,结果所有菌株均扩增出了相应的特异片段,其中6株为1型,5株为7型,1株为5型,29株为9型。     

3株猪胸膜肺炎放线杆菌山东株的分离及鉴定

从山东省几个猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎病例中,采集病猪的肺脏、气管和扁桃体等病变组织,经细菌分离得到3个分离株BZ1株、BZ2株、BZ3株。经过革兰氏染色镜检、菌落形态观察、培养特性试验、生化试验、药敏试验、动物感染试验等一系列细菌学鉴定方法,可将3株分离菌鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型PCR程序优化及分子鉴定

猪接触性传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）又称坏死性胸膜肺炎,是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征。各种年龄、性别的猪对本病均易感,急性者死亡率高,慢性者常能耐过。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌有15个血清型,不同血清型之间没有或仅有较弱的交叉保护作用,这给猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的诊断防治和免疫预防带来了很大的困难。因此建立一种快速血清型分子鉴定方法尤为重要。为了快速、简便的建立猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定的方法,本研究所从临床发病疑似病例猪肺脏和气管中分离到的放线杆菌,首先经过血清型鉴定,确定部分血清型为2型,为了确定血清型鉴定的准确性,在此基础上,采用分子鉴定的方法,对这些菌株进行鉴定,确定分离到的11株菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型。这为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及防治提供了理论依据,为今后临床血清型定型提供了一种简便方法。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的鉴定和耐药性研究

猪传染性胸膜肺炎是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuralpneumoniae,APP)引起的一种高度传染性呼吸道疾病,临床上准确鉴定该病原菌并合理选择抗生素施药十分重要。研究比较了应用传统方法、PCR方法和MALDI TOF方法鉴定45株临床APP,并比较了三种优势血清型的毒力表型,最后测定了其对临床34种常见抗生素的MIC。结果发现MALDI TOF微生物学鉴定方法具有快速、准确的优势;临床菌株血清型主要包括3型（20株）、1型（13株）、7型（7株）,其他血清型菌株5株,其中1型毒力最强;APP对罗红霉素、头孢噻呋、恩诺沙星、氨苄西林等高度敏感,对四环素、土霉素等耐药率较高。研究为临床快速鉴定APP和合理选择用药提供了参考依据,为APP临床耐药折点的制定奠定了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌参考株抗血清的制备及野毒株血清型鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全部12个血清型的国际参考菌株接种于培养基大量培养。回收菌体、甲醛灭活后，加入蜂胶佐剂制成疫苗。分别免疫健康的试验用白兔。获得针对该菌单一血清型的抗血清。虽然不同血清型间有一定的交叉反应，但对同源菌株的菌体抗原的凝集效价最高。分别可达6～8个log2。用该套血清对2003年从山东省各地分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌野毒株11株进行了血清型鉴定。分别为3型（2株）、4型（1株）、5型（4株）和7型（4株）。     

地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

利用PCR反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650 bp的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102 个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。     

猪胸膜肺炎放线杆菌脂多糖的制备及对小鼠的免疫保护作用

采用酚-水法制备血清3型、4型、5型、7型和8型猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）脂多糖（LPS），以该多糖免疫小鼠，进行同源攻毒保护试验，结果LPS在20斗∥只的免疫剂量下可对小鼠产生较强的保护作用，用同血清型菌株对免疫后的小鼠攻毒，仅表现肺脏轻微出血，无死亡，而对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺脏严重出血；小鼠免疫后第2d就可以检测到抗体，并且抗体水平上升较快，到第6d抗体达到最高水平，之后，抗体水平开始下降，但下降幅度不大，可持续2个月左右；交叉保护试验结果表明血清3型LPS对血清5型和7型APP，血清4型LPS对血清5型和7型APP没有保护作用，免疫后的小鼠攻毒仍表现多数死亡；血清3型LPS对血清4型和8型APP有交叉保护作用，血清4型LPS对血清3型和8型APP有交叉保护作用，血清5型、7型、8型LPS对5个血清型的APP都有交叉保护作用，免疫后的小鼠攻毒无死亡，仅表现肺脏有不同程度的出血。上述结果表明LPS是APP的主要免疫保护性抗原之一，该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。