枯草芽孢杆菌胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶的纯化

采用弱阴离子树脂 DEAE-52 和蓝色琼脂糖凝胶 FF 层析对枯草芽孢杆菌产生的胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶的粗酶液进行 2 步纯化,得到电泳纯的二氢硫辛酰胺脱氢酶,纯化倍数为59.7,收率为46.9%.通过 SDS-PAGE 法测得其亚基分子质量为64.6 ku,Superdex 75 法测得其分子质量为67.5 ku,表明枯草芽孢杆菌 WY34 产胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶为单亚基蛋白质.本研究采用的二氢硫辛酰胺脱氢酶的纯化方法,简便且收率较高.     

猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探

目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌C-36纤维索酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2+、Pb2+、Fe3+对酶有抑制作用,Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。     

枯草芽孢杆菌WHNB 02植酸酶的酶学性质研究

从118份样品中分离到1株产植酸酶的枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis WHNB02）,其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶,纯化倍数约为31．5倍,回收率为13．0％。该酶为单体酶,SDS—PAGE测得的分子量约为43KD,以植酸钠为底物的Km值为0．5mmol／L,酶反应的最适温度为60℃,80℃作用10min酶活保存61％,最适pH为7．0,在pH6．0—10．0范围内稳定,酶活性及稳定性都需Ca^2＋存在。EDTA,Mn^2＋,Ba^2＋（5mmol／L）对酶活具有很大的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2 、Pb2 、Fe3 对酶有抑制作用,Ba2 、Fe2 对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。     

小麦内生枯草芽孢杆菌E1R-j胞外抗菌蛋白的分离纯化和性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、疏水层析、PAGE切胶电洗脱、阴离子交换层析从E1R-j发酵滤液中分离纯化得到抗菌蛋白j1.经测定,j1分子量为51.9 kDa,等电点为8.7.j1不能催化昆布多糖、壳聚糖、羧甲基纤维素的水解;但能催化酪蛋白水解,其相对蛋白酶活性为384.67 U/mL.j1对蛋白酶K不敏感,具有很好的热稳定性(121℃),在pH 5～9 范围内表现稳定.对供试的5种病原真菌,j1仅对小麦全蚀病菌和苹果轮纹病菌有抑制作用.其中,对小麦全蚀菌的抑制中浓度IC50为 0.14 μg/mL.     

枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质的性质

用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性,研究结果表明:硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质浓度分别为17.261μg/m l和18.899μg/m l,上述两者对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性;当温度高于40℃时抑菌活性均降低,但在120℃时仍有部分抑菌活性;对pH值适应范围较宽,但在pH值为13.6时抑菌活性均丧失;经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性均下降。SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌B-916能分泌多种蛋白质,其中硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质中相对分子质量为48 000的蛋白质可能为抗菌蛋白质。硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质经Sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰。     

重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的纯化和性质研究

研究嗜热枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组酶的纯化和性质。该基因序列全长723bp,编码240个氨基酸。根据基因同源性分析,该壳聚糖酶与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的壳聚糖酶前体基因的同源性最高,为98%。粗酶液经Ni-IDA亲和层析得到电泳级纯酶,比活力高达1 051.8U/mg。经测定,该酶反应最适温度为45℃,最适pH为6.0,在40℃和pH 4.5～8.0下稳定。该酶为内切壳聚糖酶,能够高效降解壳聚糖,生成一系列的壳寡糖,在壳寡糖的制备生产方面具有广阔的应用前景。     

枯草芽孢杆菌B21抗菌蛋白的分离纯化及特性研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B21对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)有较强的抑制作用,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白.为明确该抗菌蛋白的理化性质,利用饱和硫酸铵沉淀法得到拮抗粗提蛋白,所获粗提蛋白不耐高温,对胰蛋白酶和蛋白酶K部分敏感,对链霉蛋白酶不敏感而对氯仿敏感,作...     

枯草芽孢杆菌WHNB 02植酸酶的酶学性质研究

从118份样品中分离到1株产植酸酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WHNB 02),其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶,纯化倍数约为31.5倍,回收率为13.0%.该酶为单体酶,SDS-PAGE测得的分子量约为43 KD,以植酸钠为底物的Km值为0.5 mmol/L,酶反应的最适温度为60℃,80℃作用10 min酶活保存61%,最适pH为7.0,在pH 6.0～10.0范围内稳定,酶活性及稳定性都需Ca2+存在.ED-TA,Mn2+,Ba2+(5 mmol/L)对酶活具有很大的抑制作用.     

枯草芽孢杆菌XM16分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化

以苹果腐烂病菌等22种植物病原真菌为供试菌,研究了枯草芽孢杆菌XM16无菌滤液的抑菌活性,结果表明,该无菌滤液对供试的植物病原菌具有强烈的抑制作用,抑菌谱非常广。无菌滤液经硫酸铵盐析,然后过Sephacryl S-100HR凝胶柱进一步分离纯化,获得2种不同组分的具强抑菌作用的抗菌蛋白。SDS-PAGE电泳显示,2种蛋白的分子量分别为21kD和30kD。     

枯草芽孢杆菌QM3抗真菌蛋白的稳定性

枯草芽孢杆菌QM3是从青海牦牛粪中分离筛选出的1株对植物病原真菌高效拮抗菌株,为了开发和应用QM3菌株,本研究探讨了QM3抗真菌蛋白的稳定性.采用硫酸铵盐析、SDS-PAGE凝胶电泳从其发酵液中分离抗真菌蛋白,并采用对峙生长法分析了该蛋白的稳定性.结果显示:60%饱和硫酸铵盐析得到的蛋白具有较好的抑菌活性,其分子量约为...     

类芽孢杆菌胞外胆固醇氧化酶的分离纯化

[目的]探讨类芽孢杆菌产生胞外胆固醇氧化酶(COD)的分离、纯化方法,为其生产和应用提供技术支持.[方法]将类芽孢杆菌发酵液通过旋转蒸发浓缩、蔗糖透析浓缩、DEAE离子交换柱层析和凝胶层析,纯化目的蛋白,然后测定获得酶的基本酶学性质.[结果]类芽孢杆菌发酵液经DEAE离子交换柱层析和SephadexG-75凝胶柱层析后,纯化所得的COD比活力达6.83U/mg,酶活力回收为35.6%,纯化倍数为13.4倍.纯化酶经SDS-PAGE显示为均一条带,分子量约58 kDa.将纯化的COD作用于不同浓度胆固醇,采用Lineweaver Burk作图法,测得其Km=3.3×10-5 mol/L.薄层层析结果显示,产物为胆甾-4-烯-3-酮,说明纯化所得酶是COD.[结论]纯化获得电泳纯类的芽孢杆菌胞外COD,其与底物亲和力较强,具有潜在的应用研究价值.     

苹果树腐烂病菌拮抗枯草芽孢杆菌E1R-j抗菌蛋白的分离纯化

【目的】从枯草芽孢杆菌E1R-j菌株的发酵液中分离纯化抗菌蛋白,分析确其对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制作用,为更好地利用该菌株防治植物病害和研制生物农药奠定基础。【方法】采用盐酸沉淀法从E1R-j发酵液中提取粗蛋白,并筛选酸沉淀的最佳pH值,然后通过反相柱RESOURCETMRPC、凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析技术,提取并分离纯化粗蛋白;在粗蛋白分离纯化过程中,以皿内对峙试验测定蛋白的抗菌活性;通过扫描电镜技术,观察抗菌蛋白对病原菌菌丝的抑制作用。【结果】以pH 4.0盐酸沉淀获得的粗蛋白活性最强,抑菌效果最佳。反相柱RESOURCETMRPC获得的活性峰收集物经凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析后,得到1个对称的活性峰,其收集物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测为单一条带,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱中显示有2个分子质量相近的条带,表明该抗菌蛋白可能含有2个亚基,2个亚基的分子质量分别为55和60ku,将该活性蛋白命名为EP-1。扫描电镜结果显示,抗菌蛋白EP-1可使苹果树腐烂病菌菌丝出现膨大、弯曲以及原生质外渗等现象。【结论】通过盐酸沉淀及柱层析技术,从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离纯化出一种分子质量为115ku的抗菌蛋白EP-1,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显的抑制和破坏作用。     

枯草芽孢杆菌发酵产N-乙酰神经氨酸的分离提纯

[目的]对GRAS认证的枯草芽孢杆菌发酵所得N-乙酰神经氨酸进行分离纯化,获得安全性高的目的产物。[方法]通过沸水浴破壁、菌液分离、活性炭脱色、乙醇分步沉淀除杂、乙酸结晶以及重结晶等工艺对枯草芽孢杆菌基因工程菌株经培养所得的N-乙酰神经氨酸发酵液进行分离纯化。[结果]分离纯化后,N-乙酰神经氨酸纯度在96.0%以上。[结论]研究结果为N-乙酰神经氨酸应用于食品、保健品等领域提供了质量保障。     

枯草芽孢杆菌植酸酶的研究进展

 枯草芽孢杆菌通能过分泌植酸酶分解植酸，释放磷元素，促进动植物磷的吸收。主要综述了枯草芽孢杆菌植酸酶作用机理、酶学性质、分离纯化、分类地位和基因工程方面的研究进展，以便为该酶的深入研究和应用提供借鉴作用。     

利用基因工程改良枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用,能产生40多种具有不同结构的抗生素,许多具有优良性状的菌株已成功应用于植物病害的生物防治。采用基因工程技术提高生防枯草芽孢杆菌菌株的拮抗性能、扩大其防治对象,现已成为生物防治研究的热点,并取得了一系列突破性进展。本文从导入外源拮抗基因、提高抗生素表达量、基因突变重组合成新型抗生素、扩大防治对象等方面,综述了最近基因工程改良生防枯草芽孢杆菌的研究进展,并探讨了以后的研究方向。     

浅谈枯草芽孢杆菌的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种有益的土壤细菌,本身具有对环境友好、对粮食作物安全、对人畜无害等优点而受到了人们的普遍关注和深入研究。枯草芽孢杆菌具有发达的分泌系统和较强的环境适应性,在农业生产中广泛应用。枯草芽孢杆菌对多种病原菌都具有拮抗性能,在农业生产中可用于防治多种植物病害,如用来防治辣椒炭疽病、水稻纹枯病以及一些镰刀菌引起的病害。     

枯草芽孢杆菌的应用研究进展

论述了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生物学特性、发展概况和在工业、农业、食品、医药卫生、畜牧业和水产养殖及科学研究等领域中的广泛应用。     

枯草芽孢杆菌rocG基因插入失活突变株的构建

枯草芽孢杆菌中有2个编码谷氨酸脱氢酶(GDH)的基因:rocG基因和gudB基因。其中Bacillus subtilis 168菌株的rocG基因编码有活性的GDH,而gudB基因编码没有活性的GDH。敲除168菌株的rocG基因后,gudB基因会自发突变为gudB1基因,后者编码有活性的GDH(gudB1-GDH)。为了研究gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制,构建了pMUTin4-rocG插入突变重组质粒,将其转化至B.subtilis 168,成功获得了1株rocG失活突变株BS-△rocG。对BS-△rocG和野生株的生长情况及GDH酶活进行了比较,发现BS-△rocG生长情况和野生株相当,但其GDH酶活为4.641U/mg蛋白,高于野生株的3.042U/mg蛋白。由此推测BS-△rocG中,gudB可能自发突变为gudB1,从而能够编码有活性的GDH,这一结果为研究枯草芽孢杆菌gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制奠定了基础。