猪圆环病毒2型ORF2单克隆抗体的制备与鉴定

以杆状病毒表达系统表达PCV2ORF2重组蛋白为免疫原,旨在获得针对PCV2的特异性单克隆抗体。用Sf9细胞表达PCV2ORF2重组蛋白,通过层析柱和超滤管浓缩法纯化PCV2ORF2重组蛋白。将纯化的PCV2ORF2重组蛋白免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,3次免疫后,取免疫后小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA筛选,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1H9、4C11、5B8和4F12株。IFA和Western blot试验说明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体能与ORF2重组蛋白作用。特异性试验表明,4F12株单克隆抗体与猪圆环病毒2型(PCV2KQ22株)发生特异性反应,经抗体亚型鉴定1H9、4C11和5B8 3株亚型为IgG1/Kappa,4F12株为IgG2b/Kappa,1H9、4C11、5B8和4F12株小鼠腹水效价分别为105、104、106和105。表明获得了与PCV2特异性作用的单克隆抗体。     

猪圆环病毒3型Rep蛋白的表达与多克隆抗体制备

为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Rep基因在大肠杆菌中表达产物的反应原性和免疫原性,本试验对Rep基因进行原核表达和纯化,鉴定表达产物与PCV3阳性血清的反应性;制备重组Rep蛋白的多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体与重组Rep蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,Rep在大肠杆菌中获得大量表达,且主要以包涵体形式存在,重组蛋白相对分子质量约为32 000,经纯化后得到单一条带。表达的重组Rep蛋白可以与PCV3阳性血清发生反应。制备的大鼠抗Rep血清与表达的重组Rep蛋白发生特异性反应,且效价大于1∶32 000。表明本试验表达的Rep具有良好的免疫原性和反应原性,为PCV3的ELISA诊断试剂盒研制提供依据。     

猪圆环病毒2型Rep’蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备猪圆环病毒2型Rep’蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep’蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep’和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep’蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep’蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep’蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建的基因工程重组菌BL21(DE3)表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2编码的结构蛋白,经切胶纯化后作为免疫原。采取抗原量依次递增的免疫方式免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,有限稀释法进行亚克隆3次,最终获得4株稳定分泌抗PCV2 ORF2重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为D2A1、H4G2、B10H10和G1G2。经ELISA检测,其腹水效价分别达到1∶2.048×107、1∶2.56×106、1∶1.28×106、1∶2.56×106。亚型鉴定4株单克隆抗体均属IgG2a亚型,其轻链均为κ链。Western blot鉴定表明获得的4株单克隆抗体均能特异性的识别43 kD的重组PCV2 ORF2蛋白。在间接免疫荧光试验中,单抗D2A1株的反应为阴性,H4G2、B10H10和G1G2反应为阳性,表明后3株单抗能够识别天然的PCV2 ORF2蛋白表位。本试验为进一步研究PCV2ORF2基因的功能及建立快速准确的诊断PCV2的方法奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2重组蛋白单抗,以纯化复性的ORF2重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经ELISA筛选出了3株分泌PCV2ORF2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7.3株细胞的培养上清中抗体效价分别为1:3 125、1:3 125、1:15 625,小鼠腹水效价分别为1:390 000、1:390 000、1:1 950 000;Western blot显示,3株单克隆抗体均能与PCV2ORF2重组发生特异性反应;辣根过氧化酶偶联4G8F7制成的酶标单抗,测定结果显示其最佳工作浓度为1:2 000.结果表明本研究利用体外重组表达PCV2ORF2融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体.     

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶64 00,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12 800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈...     

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40 000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b, 13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体，将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合，密码子按大肠杆菌偏嗜性优化，构建了大肠杆菌表达质粒，制备获得重组M蛋白。取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白，将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3 200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a, 3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定，4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应，鉴定出2个抗原表位，为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用已构建的基因工程重组菌表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2编码的Cap蛋白,纯化后作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接免疫荧光试验(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后,本试验最终获得5株稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3D12、4D5、4B9、4C9和4G10。其中4D5为IgG2b亚型,其余4株单克隆抗体均为IgG1亚型,轻链类型均为κ。Western blotting鉴定结果表明获得的5株单克隆抗体均不能特异性的识别47 ku重组PCV2 Cap蛋白;对病毒感染细胞进行IFA试验,结果显示5株单克隆抗体均特异性的识别病毒抗原,表明5株单克隆抗体识别的抗原表位均为构象表位。中和试验结果表明,5株单克隆抗体均有中和活性。本试验结果为进一步探索ORF2基因的结构、功能及建立快速准确的诊断方法奠定了基础。     

副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备

为获得副流感病毒5型SH蛋白的单克隆抗体，将构建的重组表达质粒pET43a-SH转化BL21(DE3)plys，经IPTG诱导表达、过镍柱纯化后将重组蛋白作为免疫原，免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光方法进行筛选，获得3株杂交瘤细胞株，命名为5B9、3G8、4E11，并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传代10代均稳定分泌单克隆抗体，细胞上清液IFA效价稳定，分泌单克隆抗体亚型均为IgG2a。制备并纯化了1株(5B9)单克隆抗体，浓度为4.26 mg/mL，纯度不低于90%，IFA效价不低于1∶2000，与猪牛等常见病毒均无交叉反应。     

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51 200和1∶102 400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。     

山羊IL-9基因克隆表达与单克隆抗体的制备

为了研究捻转血矛线虫诱导山羊产生Th9型免疫应答的特点,制备了抗山羊IL-9单克隆抗体。采用基因克隆、表达和纯化得到重组蛋白IL-9,并以重组IL-9为免疫原,重组蛋白IL-9和His-tag为筛选抗原,通过杂交瘤细胞技术,筛出1株稳定分泌抗山羊IL-9单克隆抗体细胞株,命名为6A11A8。将该细胞株接种小鼠腹腔,制备腹水,并将纯化后的抗体与生物素耦合,用流式细胞术检测山羊外周血单核细胞(PBMCs)中表达IL-9的细胞亚类。结果显示:融合蛋白大小约为16 ku,主要分布于包涵体中,筛选出的6A11A8细胞株产生的抗体效价高、特异性强,其细胞上清抗体效价可达1∶2430,其抗体亚型为IgG2bκ,层析柱纯化小鼠腹水后其效价可达1∶512 000,该单抗可识别山羊PBMCs中分泌IL-9的亚类细胞。结论:本研究获得了山羊IL-9单克隆抗体,为研究山羊Th9型免疫反应奠定了基础。     

猪γ干扰素单克隆抗体的制备与特性研究

为了制备高特异性的抗猪γ干扰素(IFN-γ)抗体,试验采用原核表达的携带His标签的重组猪IFN-γ(PoIFN-γ)蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备杂交瘤细胞;并以携带GST标签的重组蛋白PoIFN-γ(GST-PoIFN-γ)为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选稳定分泌抗体的单克隆细胞株;而后通过间接ELISA方法、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定和间接免疫荧光方法对获得的单克隆抗体的腹水效价、亚型、反应特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明：经筛选后共获得7株能稳定分泌PoIFN-γ的单克隆抗体细胞株;7株单克隆抗体的腹水效价在1∶2 048 000～1∶16 384 000之间,均为IgG1亚型,均能与原核表达及真核表达的PoIFN-γ蛋白发生特异性反应且反应性良好。说明试验成功制备了可特异性识别PoIFN-γ的单克隆抗体。     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的核衣壳蛋白(N),并进一步制备其单克隆抗体。将构建重组原核表达质粒pET28a-N转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白,并采用Ni-NTA亲和层析和分子筛进行纯化。将纯化后的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其分泌抗体的特性进行了分析。结果显示:重组质粒pET28a-N在E.coli BL21中高效表达,筛选获得了2株稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A3和4F6,其分泌的抗体均为IgG1亚型,腹水效价分别为5.12×10~5、1.28×10~5。本研究为进一步研究N蛋白的功能以及建立PEDV免疫学诊断方法奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白的单克隆抗体(MAb),试验利用原核表达融合蛋白His-M免疫7周龄雌性Balb/c小鼠,以PK-15细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,并采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(2G1、2G2),经检测其细胞培养上清液和诱导的小鼠腹水抗体效价分别可达到1∶3 200和1∶1×10~5;连续培养15代及液氮冻存后复苏,抗体效价稳定;单克隆抗体亚型鉴定均为IgG1,轻链均为k链;MAb能够特异性识别TGEV。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)NP蛋白的单克隆抗体,将构建的重组表达质粒pET-30a-NP转化BL21细胞,经IPTG诱导表达、纯化后作为免疫原,免疫8周龄Balb/c雌性小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过ELISA方法、Western-blot方法进行筛选,获得3株杂交瘤细胞株,命名为3A6、2H12、5F7,并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传10代均稳定分泌单克隆抗体,分泌的单克隆抗体亚型均为IgG2b,轻链类型均为Kappa。制备并纯化了以上3株单克隆抗体,浓度分别为2.9、2.5、2.8 mg/mL,纯度不低于90%。West-blot检测,单抗与H7血凝抑制试验抗原、H5血凝抑制试验抗原、H9N2病毒能发生特异性反应,说明单抗具有广谱性,且与IBDV、REV、IBV、MDV、ALV、AE、ILT、NDV、EDSV等均无特异性条带出现,说明特异性良好。本研究制备的3株针对禽流感NP蛋白的单抗,具有较好的特异性、保守性和广谱性,为下一步开展AIV诊断试剂如IFA检测试剂盒、ELISA检测试...     

猪NLRP3单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

为制备猪炎症小体NLRP3的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies, MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NLRP3作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选获得了3株能稳定分泌NLRP3蛋白的杂交瘤细胞株9H5、13E1、15E2,鉴定了抗体亚类,将目的蛋白逐步截短后鉴定出了单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,MAb 9H5和15E2识别的抗原表位序列在1～57 aa之间,MAb 13E1识别的表位序列在115～186 aa之间。免疫荧光、Western blot和亚类鉴定试验显示,杂交瘤细胞产生的抗体均可与NLRP3及重组蛋白特异性结合,9H5、13E1、15E2的重链亚型均为IgG 2b,轻链分别为λ、λ和κ链。本研究成功制备了猪NLRP3的单克隆抗体,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的功能提供工具。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。